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內(nèi)毒素（ET)在革蘭氏陰性細(xì)菌感染發(fā)病機(jī)理中起著十分重要的作用。尾靜脈注射ET建立大鼠內(nèi)毒素血癥模型，并觀察多價(jià)陽(yáng)離子A（CA）對(duì)其的保護(hù)效應(yīng)，結(jié)果顯示ET組中各時(shí)間段的肝細(xì)胞凋亡指數(shù)一直上升，CA組的肝細(xì)胞凋亡及病理組織學(xué)改變較輕；ET可上調(diào)c-myc基因和下調(diào)Livin基因的表達(dá)，從而促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，CA則能明顯下調(diào)c-myc基因和上調(diào)Livin基因的表達(dá)，從而抑制肝細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)研究?jī)?nèi)毒素(ET)對(duì)大鼠肝臟c-myc、Livin基因的表達(dá)變化、肝細(xì)胞凋亡情況及陽(yáng)離子A(CA)的保護(hù)效應(yīng)。將72只清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為3組：第Ⅰ組為NS對(duì)照組(n=24)、第Ⅱ組為ET致病組(n=24)、第Ⅲ組為ET+CA保護(hù)組(n=24），三組動(dòng)物經(jīng)相應(yīng)處理后分別在3h、4h、8h、12h采集肝臟作為樣本。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠注射ET后，經(jīng)PI染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果表明對(duì)照組肝細(xì)胞的凋亡率在3h、4h、8h、12h時(shí)分別為2.45％、2.71％、3.28％、3.06％；ET組肝細(xì)胞凋亡率在3h、4h、8h、12h時(shí)分別為10.98％、14.75％、19.23％、24.13％，明顯高于各同時(shí)期對(duì)照組(P<0.01)，且隨著時(shí)間的增加而增加，這提示了ET能顯著促進(jìn)肝細(xì)胞的凋亡。 c-myc基因作為一個(gè)參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的主要基因，可激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路。本研究實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，對(duì)照組和ET組均能檢測(cè)到熒光信號(hào)，方差分析結(jié)果表明ET組c-myc基因相對(duì)拷貝數(shù)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。免疫組化結(jié)果顯示，在對(duì)照組和ET組均有c-myc基因的表達(dá)，t檢驗(yàn)結(jié)果表明c-myc基因ET組在肝臟表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可判斷，ET組肝臟c-myc基因的表達(dá)隨時(shí)間的增加一直呈上升趨勢(shì)。本研究結(jié)果顯示，ET可明顯誘導(dǎo)c-myc基因表達(dá)的上調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 Livin是最近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族中的新成員，是一種作用很強(qiáng)的凋亡抑制因子。 本研究實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，對(duì)照組和ET組均能檢測(cè)到熒光信號(hào)，方差分析結(jié)果表明肝臟ET組Livin基因的相對(duì)拷貝數(shù)極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。免疫組化的研究結(jié)果顯示，在對(duì)照組和ET組均有Livin基因的表達(dá)，方差分析結(jié)果表明Livin基因在ET組肝臟表達(dá)均明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。由此可以看出，ET組肝臟Livin基因的表達(dá)變化隨時(shí)間增加呈下降趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ET能下調(diào)Livin基因的表達(dá)，使肝細(xì)胞凋亡加劇，這是造成肝細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。 Rietschel認(rèn)為干擾ET結(jié)構(gòu)或干擾含有ET結(jié)構(gòu)的膜的藥物都可以幫助殺死細(xì)菌。David等在對(duì)內(nèi)毒素拮抗的研究中發(fā)現(xiàn)帶正電荷的藥物是通過(guò)其所帶正電荷基因與內(nèi)毒素脂質(zhì)A上的磷酸基團(tuán)結(jié)合，從而破壞內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)及其生物活性。本實(shí)驗(yàn)以CA作為多價(jià)陽(yáng)離子拮抗劑進(jìn)行內(nèi)毒素保護(hù)作用的研究，CA的保護(hù)效應(yīng)表現(xiàn)在c-myc基因和Livin基因的表達(dá)變化上。本實(shí)驗(yàn)中用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR測(cè)定的結(jié)果顯示，CA保護(hù)組肝臟c-myc基因相對(duì)拷貝數(shù)在8h極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，3h、4h、12h顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；3h顯著低于ET組(P<0.05)；4h、8h、12h極顯著低于ET組(P<0.01)。CA保護(hù)組肝臟Livin基因相對(duì)拷貝數(shù)在3h顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，4h、8h、12h 極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；4h顯著高于ET組(P<0.05)，3h、8h、12h極顯著高于ET組(P<0.01)。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CA保護(hù)組c-myc基因表達(dá)蛋白3h、4h、8h、12h的積分光密度極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，極顯著低于ET組(P<0.01)。CA保護(hù)組Livin基因表達(dá)蛋白3h、4h、8h、12h的積分光密度極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，極顯著高于ET組(P<0.01)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，CA保護(hù)組肝臟c-myc基因的表達(dá)變化呈先上升后下降的趨勢(shì)，而Livin基因的表達(dá)變化則呈先下降后上升的趨勢(shì)。如前所述，c-myc是促凋亡基因，Livin是抗凋亡基因，因此，與ET組相比，CA保護(hù)組c-myc基因表達(dá)的降低和Livin基因表達(dá)的升高，必然使肝細(xì)胞凋亡受到抑制。其原因是CA下調(diào)c-myc基因的表達(dá)和上調(diào)Livin基因的表達(dá)抑制肝細(xì)胞的凋亡。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，CA對(duì)由ET誘導(dǎo)的肝臟損傷有明顯的保護(hù)效應(yīng)，這為臨床防治內(nèi)毒素血癥和開(kāi)發(fā)抗內(nèi)毒素藥物提供理論依據(jù)。

第十二屆“挑戰(zhàn)杯”作品 三等獎(jiǎng)
2011年4月獲得校級(jí)第九屆“挑戰(zhàn)杯”學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽一等獎(jiǎng) 2011年5月獲得第六屆云南高校青年學(xué)術(shù)科技節(jié)自然科學(xué)類二等獎(jiǎng)