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探討仙人掌乙醇提取物和超聲波提取物對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25293)，大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25922），白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 90029）三種微生物的體外抑菌效果及其抑菌機(jī)制。方法：乙醇提取法和超聲波提取法提取仙人掌原液，并用K-B法分別測(cè)仙人掌提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的抑菌效果，常量稀釋法檢測(cè)MIC，并以抑菌曲線初步探討其抑菌機(jī)制。結(jié)果：兩種方法提取的仙人掌原液對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株均有抑制作用，抑菌曲線表明，乙醇提取物原液能抑制金黃色葡萄球菌在遲緩期和對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)以及抑制大腸桿菌在遲緩期的生長(zhǎng)。結(jié)論：大理地區(qū)的單刺仙人掌提取物對(duì)本實(shí)驗(yàn)的革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌和真菌均有抑菌作用，兩種方法提取的仙人掌提取物的抑菌效果有所不同。本研究可為仙人掌提取物的進(jìn)一步研究和應(yīng)用打下理論基礎(chǔ)。

仙人掌含有豐富的類黃酮化合物、生物堿、甾類化合物及有機(jī)酸等成分，它們是各種植物中常見的對(duì)食品中腐敗菌及致病菌具有抑制效果的化學(xué)成分。仙人掌將成為食品天然防腐劑的重要來源之一。
在我國(guó)仙人掌的莖、花果均有食用和藥用的傳統(tǒng)其性苦、涼具有清熱解毒、散瘀健胃滋養(yǎng)、強(qiáng)壯、補(bǔ)脾、鎮(zhèn)咳、安神、行氣活血、清熱涼血、減肥降壓等功效。其次，“米邦塔”仙人掌原汁對(duì)幾種常見的細(xì)菌性皮膚病有良好的抑菌作用[7]。進(jìn)行仙人掌提取物的抑菌的抑制作用及抑菌機(jī)理的研究，可為開發(fā)利用仙人掌資源奠定一定的基礎(chǔ)，本文通過對(duì)大理地區(qū)的單刺仙人掌提取物的總活性成分進(jìn)行三種代表菌的抑菌效果研究，為其作為藥物臨床應(yīng)用或作為食品提供理論參考。目前，全世界正面臨化學(xué)抗生素危機(jī)，因此，越來越多的人把眼光放到了天然植物活性物質(zhì)的研究上，從而使仙人掌這種傳統(tǒng)抗菌藥材得到了人們?cè)絹碓蕉嗟闹匾?。近幾年來，?guó)內(nèi)外對(duì)仙人掌的抑菌作用雖然有所研究，但目的主要用于食品防腐，對(duì)于一些致病性較強(qiáng)且能引起多種疾病的病菌的抑制作用鮮見報(bào)道。
1、材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)菌株、試劑和主要儀器
標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25923） 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 90029) 由XX學(xué)院病原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，大理單刺仙人掌由小組成員赴大理市下關(guān)鳳儀采得，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、沙保弱培養(yǎng)基、瓊脂粉、無(wú)水乙醇、丙三醇、購(gòu)自大理浩達(dá)試劑公司，超凈臺(tái)、雙目物影顯微鏡、電子天平、恒溫箱、立式壓力蒸汽滅菌器、烘烤箱、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、搖床、游標(biāo)卡尺、加樣槍及槍頭、0.5麥?zhǔn)媳葷峁芗氨葷岚濉P管、離心管、毛細(xì)吸管、試管及塞子、試管架、滴管、移液管、燒杯、酒精燈、玻璃漏斗、打孔器、培養(yǎng)皿、錐形瓶、由XX學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000）、真空冷凍干燥器、粉碎機(jī)、抽濾瓶、由XX學(xué)院藥化實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2仙人掌的采摘
取2kg經(jīng)XX 學(xué)院藥學(xué)院專家鑒定后的單刺仙人掌，去刺洗凈切條后置于烘烤箱中60℃，96h，烘干后粉碎。
1.3乙醇提取法提取仙人掌原液
新鮮仙人掌80%乙醇，充分振蕩，浸取40h，取上清液，渣中加入600mL 80%乙醇充分振蕩，浸取48h，取上清液后并兩次上清液負(fù)壓抽濾，減壓濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，得到固體提取物10.61g。
1.4超聲波提取法提取仙人掌原液[16]
仙人掌粉末20g 80%乙醇1:20浸泡6h，超聲波（頻率70k/Hz放射1s，間歇1s），作用20min過濾，取濾渣添加80%乙醇400mL，超聲波放射，合并兩次濾液，4℃冰箱過夜沉淀多糖，4500r/min，離心10min，取上清液，真空冷凍干燥，得到提取物3.45g。
1.5藥物紙片制備[17]
將直徑7mm的圓形濾紙片放入EP管中121℃滅菌30min，分別加入提取的仙人掌超聲波和乙醇提取物，制成含仙人掌提取物0.4g/mL的藥物濾紙片，置于滅菌平皿中備用。
1.6 K-B法仙人掌原液的體外抑菌試驗(yàn)
制備0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，約含1×108-2×108CFU/mL，用棉簽接種MH培養(yǎng)基，用鑷子以無(wú)菌操作技術(shù)放置制備的含仙人掌提取物的藥物紙片。各紙片圓心之間的距離大于25mm，藥物紙片圓心距平板邊緣大于15mm，每一種樣品重復(fù)兩次，以相應(yīng)質(zhì)量濃度的乙醇作為對(duì)照，然后將貼好藥物紙片的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)皿放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，白色念珠菌的放入28℃的恒溫箱中28h，到時(shí)間后分別用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑[18]。
1.7 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定
采用試管稀釋法對(duì)0.1g/mL的仙人掌提取液進(jìn)行梯度稀釋，各梯度分別為0.1g/mL、0.05g/mL、0.025g/mL、0.0125g/mL、0.00625g/mL、0.003125g/mL、0.0015625g/mL、0.00078125g/mL，制備各實(shí)驗(yàn)菌株0.5麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙?，接種各稀釋度，使最終菌液濃度為5×105CFU/mL。同時(shí)設(shè)立培養(yǎng)基對(duì)照、細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)照和藥液對(duì)照，37℃培養(yǎng)24小時(shí)觀察結(jié)果，以完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低提取物濃度為其MIC[19-20]。
1.8 抑菌機(jī)制的初步研究
取7只錐形瓶經(jīng)消毒后各加入MH培養(yǎng)基18mL，1號(hào)和2號(hào)在分別加入0.25g 80%乙醇提取物后，1號(hào)加入0.5麥?zhǔn)蠁挝坏慕瘘S色葡萄球菌2mL，2號(hào)加入0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇竽c桿菌2mL；3號(hào)和4號(hào)在分別加入0.5g超聲波提取物后，3號(hào)加入0.5麥?zhǔn)蠁挝坏慕瘘S色葡萄球菌2mL，4號(hào)加入0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇竽c桿菌2mL。5號(hào)為和6號(hào)分別為不加藥物的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對(duì)照組，7號(hào)為不加細(xì)菌的培養(yǎng)基對(duì)照。置于搖床200rmp/min，37℃培養(yǎng)，分別于0h、3h、6h、9h各取樣100uL。放入滅菌后的96孔微孔板酶標(biāo)儀測(cè)A600值，以推算活菌數(shù)，以活菌數(shù)作為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)利用Excel繪制抑菌曲線。
2.結(jié)果
2.1 K-B法檢測(cè)抑菌效果
仙人掌80%的乙醇提取物和超聲波提取物對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25923）大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25922) 和白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 90029）的抑菌效果，結(jié)果表明：①乙醇提取法優(yōu)于超聲波提取法；②乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)于大腸桿菌；③兩種提取物對(duì)真菌的抑菌作用均較弱；④兩種提取物對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌均有抑菌效果（表1）。
表1 仙人掌80%的乙醇提取物與超聲波提取物抑菌效果
菌株 抑菌圈直徑（mm）
80%乙醇提取法 超聲波提取法 乙醇對(duì)照
金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）
10.90
9.033
7.56
大腸桿菌(ATCC 25922)
10.40
8.967
7.973
白色念珠菌(ATCC 90029)
8.5
8.92
9.30

2.2 試管稀釋檢測(cè)MIC
經(jīng)試管稀釋法（圖2）檢測(cè)仙人掌80%的乙醇提取物和超聲波提取物對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25923）大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25922) 和白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株（90029）的MIC，結(jié)果表明：①80%乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)于大腸桿菌；②兩種方法所得的仙人掌提取物均有一定的抑菌效果，以乙醇提取法更好（表2）。

表2 試管稀釋法仙人掌80%乙醇提取物與仙人掌超聲波提取物的MIC
菌株 MIC
80%乙醇提取物 超聲波提取物
金黃色葡萄球菌
(ATCC 25923) 0.025 0.1
大腸桿菌
(ATCC 25922) 0.05 0.1
白色念珠菌
(ATCC 90029) 0.05 0.1

2.3 抑菌曲線的研究結(jié)果
繪制仙人掌80%的乙醇提取物和超聲波提取物對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25923） 和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25922) 的抑菌曲線，結(jié)果表明：仙人掌乙醇提取物原液能抑制金黃色葡萄球菌在遲緩期和對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)以及抑制大腸桿菌在遲緩期的生長(zhǎng)（圖4）。

3討論
本研究選用金黃色葡萄球菌為革蘭陽(yáng)性菌代表，大腸桿菌為革蘭陰性菌代表，選用白色念珠菌為真菌的代表，研究結(jié)果表明：仙人掌提取物對(duì)試驗(yàn)中的革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌以及真菌均有抑菌活性，仙人掌的乙醇和超聲波提取物對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌均有較強(qiáng)的抑制作用，但對(duì)真菌的抑制作用比前兩種弱。這一結(jié)果，在對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌的作用方面是和韓淑琴等人[21]的結(jié)果是一致的，但是，與翁佩芳[22]的結(jié)果有所不同，對(duì)真菌的作用方面，與翁佩芳等人[22]的研究結(jié)果一致，與韓淑琴[21]、胡春菊等人[23]的不同。細(xì)菌和真菌對(duì)仙人掌提取物的敏感性的差異有可能與Kepteyn所說的真菌與細(xì)菌在應(yīng)急機(jī)制上有所不同有關(guān)[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種方法所得的仙人掌提取物均有一定的抑菌效果，以80%乙醇提取物的抑菌效果較好，超聲波提取物次之，其原因有待進(jìn)一步研究。本研究對(duì)仙人掌抑菌制品的進(jìn)一步加工及其在藥用和仙人掌保健品開發(fā)方面提供了實(shí)踐依據(jù)。但是在抑菌曲線實(shí)驗(yàn)中，仙人掌乙醇提取物原液能抑制金黃色葡萄球菌在遲緩期和對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)，但只能抑制大腸桿菌在遲緩期的生長(zhǎng)。其原因可能是由于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在代謝機(jī)制上的不同有關(guān)。仙人掌乙醇提取物原液能抑制金黃色葡萄球菌在遲緩期和對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)，說明其能抑制金黃色葡萄球菌在遲緩期的大分子前體物質(zhì)的合成，并能有效抑制其在對(duì)數(shù)期細(xì)菌的二分裂繁殖。仙人掌乙醇提取物原液只能抑制大腸桿菌在遲緩期的生長(zhǎng)，說明其能抑制大腸桿菌在遲緩期的大分子物質(zhì)的合成，但對(duì)大腸桿菌在對(duì)數(shù)期的二分裂無(wú)抑制效果。

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