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探討仙人掌乙醇提取物和超聲波提取物對金黃色葡萄球菌標準株（ATCC 25293)，大腸桿菌標準株（ATCC 25922），白色念珠菌標準株（ATCC 90029）三種微生物的體外抑菌效果及其抑菌機制。方法：乙醇提取法和超聲波提取法提取仙人掌原液，并用K-B法分別測仙人掌提取物對實驗菌株的抑菌效果，常量稀釋法檢測MIC，并以抑菌曲線初步探討其抑菌機制。結果：兩種方法提取的仙人掌原液對實驗菌株均有抑制作用，抑菌曲線表明，乙醇提取物原液能抑制金黃色葡萄球菌在遲緩期和對數(shù)期的生長以及抑制大腸桿菌在遲緩期的生長。結論：大理地區(qū)的單刺仙人掌提取物對本實驗的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌和真菌均有抑菌作用，兩種方法提取的仙人掌提取物的抑菌效果有所不同。本研究可為仙人掌提取物的進一步研究和應用打下理論基礎。

仙人掌含有豐富的類黃酮化合物、生物堿、甾類化合物及有機酸等成分，它們是各種植物中常見的對食品中腐敗菌及致病菌具有抑制效果的化學成分。仙人掌將成為食品天然防腐劑的重要來源之一。
在我國仙人掌的莖、花果均有食用和藥用的傳統(tǒng)其性苦、涼具有清熱解毒、散瘀健胃滋養(yǎng)、強壯、補脾、鎮(zhèn)咳、安神、行氣活血、清熱涼血、減肥降壓等功效。其次，“米邦塔”仙人掌原汁對幾種常見的細菌性皮膚病有良好的抑菌作用[7]。進行仙人掌提取物的抑菌的抑制作用及抑菌機理的研究，可為開發(fā)利用仙人掌資源奠定一定的基礎，本文通過對大理地區(qū)的單刺仙人掌提取物的總活性成分進行三種代表菌的抑菌效果研究，為其作為藥物臨床應用或作為食品提供理論參考。目前，全世界正面臨化學抗生素危機，因此，越來越多的人把眼光放到了天然植物活性物質的研究上，從而使仙人掌這種傳統(tǒng)抗菌藥材得到了人們越來越多的重視。近幾年來，國內(nèi)外對仙人掌的抑菌作用雖然有所研究，但目的主要用于食品防腐，對于一些致病性較強且能引起多種疾病的病菌的抑制作用鮮見報道。
1、材料與方法
1.1實驗菌株、試劑和主要儀器
標準菌株：金黃色葡萄球菌標準株（ATCC 25923） 大腸桿菌標準株（ATCC 90029) 由XX學院病原微生物學實驗室保存，大理單刺仙人掌由小組成員赴大理市下關鳳儀采得，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、沙保弱培養(yǎng)基、瓊脂粉、無水乙醇、丙三醇、購自大理浩達試劑公司，超凈臺、雙目物影顯微鏡、電子天平、恒溫箱、立式壓力蒸汽滅菌器、烘烤箱、離心機、酶標儀、搖床、游標卡尺、加樣槍及槍頭、0.5麥氏比濁管及比濁板、EP管、離心管、毛細吸管、試管及塞子、試管架、滴管、移液管、燒杯、酒精燈、玻璃漏斗、打孔器、培養(yǎng)皿、錐形瓶、由XX學院微生物實驗室提供。
旋轉蒸發(fā)儀（RE-2000）、真空冷凍干燥器、粉碎機、抽濾瓶、由XX學院藥化實驗室提供。
1.2仙人掌的采摘
取2kg經(jīng)XX 學院藥學院專家鑒定后的單刺仙人掌，去刺洗凈切條后置于烘烤箱中60℃，96h，烘干后粉碎。
1.3乙醇提取法提取仙人掌原液
新鮮仙人掌80%乙醇，充分振蕩，浸取40h，取上清液，渣中加入600mL 80%乙醇充分振蕩，浸取48h，取上清液后并兩次上清液負壓抽濾，減壓濃縮后進行冷凍干燥，得到固體提取物10.61g。
1.4超聲波提取法提取仙人掌原液[16]
仙人掌粉末20g 80%乙醇1:20浸泡6h，超聲波（頻率70k/Hz放射1s，間歇1s），作用20min過濾，取濾渣添加80%乙醇400mL，超聲波放射，合并兩次濾液，4℃冰箱過夜沉淀多糖，4500r/min，離心10min，取上清液，真空冷凍干燥，得到提取物3.45g。
1.5藥物紙片制備[17]
將直徑7mm的圓形濾紙片放入EP管中121℃滅菌30min，分別加入提取的仙人掌超聲波和乙醇提取物，制成含仙人掌提取物0.4g/mL的藥物濾紙片，置于滅菌平皿中備用。
1.6 K-B法仙人掌原液的體外抑菌試驗
制備0.5麥氏比濁標準的菌懸液，約含1×108-2×108CFU/mL，用棉簽接種MH培養(yǎng)基，用鑷子以無菌操作技術放置制備的含仙人掌提取物的藥物紙片。各紙片圓心之間的距離大于25mm，藥物紙片圓心距平板邊緣大于15mm，每一種樣品重復兩次，以相應質量濃度的乙醇作為對照，然后將貼好藥物紙片的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)皿放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，白色念珠菌的放入28℃的恒溫箱中28h，到時間后分別用十字交叉法測量抑菌圈直徑[18]。
1.7 最小抑菌濃度（MIC）測定
采用試管稀釋法對0.1g/mL的仙人掌提取液進行梯度稀釋，各梯度分別為0.1g/mL、0.05g/mL、0.025g/mL、0.0125g/mL、0.00625g/mL、0.003125g/mL、0.0015625g/mL、0.00078125g/mL，制備各實驗菌株0.5麥氏濃度菌懸液，接種各稀釋度，使最終菌液濃度為5×105CFU/mL。同時設立培養(yǎng)基對照、細菌生長對照和藥液對照，37℃培養(yǎng)24小時觀察結果，以完全抑制細菌生長的最低提取物濃度為其MIC[19-20]。
1.8 抑菌機制的初步研究
取7只錐形瓶經(jīng)消毒后各加入MH培養(yǎng)基18mL，1號和2號在分別加入0.25g 80%乙醇提取物后，1號加入0.5麥氏單位的金黃色葡萄球菌2mL，2號加入0.5麥氏單位的大腸桿菌2mL；3號和4號在分別加入0.5g超聲波提取物后，3號加入0.5麥氏單位的金黃色葡萄球菌2mL，4號加入0.5麥氏單位的大腸桿菌2mL。5號為和6號分別為不加藥物的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對照組，7號為不加細菌的培養(yǎng)基對照。置于搖床200rmp/min，37℃培養(yǎng)，分別于0h、3h、6h、9h各取樣100uL。放入滅菌后的96孔微孔板酶標儀測A600值，以推算活菌數(shù)，以活菌數(shù)作為縱坐標，以時間為橫坐標利用Excel繪制抑菌曲線。
2.結果
2.1 K-B法檢測抑菌效果
仙人掌80%的乙醇提取物和超聲波提取物對金黃色葡萄球菌標準株（ATCC 25923）大腸桿菌標準株（ATCC 25922) 和白色念珠菌標準株（ATCC 90029）的抑菌效果，結果表明：①乙醇提取法優(yōu)于超聲波提取法；②乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用強于大腸桿菌；③兩種提取物對真菌的抑菌作用均較弱；④兩種提取物對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均有抑菌效果（表1）。
表1 仙人掌80%的乙醇提取物與超聲波提取物抑菌效果
菌株 抑菌圈直徑（mm）
80%乙醇提取法 超聲波提取法 乙醇對照
金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）
10.90
9.033
7.56
大腸桿菌(ATCC 25922)
10.40
8.967
7.973
白色念珠菌(ATCC 90029)
8.5
8.92
9.30

2.2 試管稀釋檢測MIC
經(jīng)試管稀釋法（圖2）檢測仙人掌80%的乙醇提取物和超聲波提取物對金黃色葡萄球菌標準株（ATCC 25923）大腸桿菌標準株（ATCC 25922) 和白色念珠菌標準株（90029）的MIC，結果表明：①80%乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用強于大腸桿菌；②兩種方法所得的仙人掌提取物均有一定的抑菌效果，以乙醇提取法更好（表2）。

表2 試管稀釋法仙人掌80%乙醇提取物與仙人掌超聲波提取物的MIC
菌株 MIC
80%乙醇提取物 超聲波提取物
金黃色葡萄球菌
(ATCC 25923) 0.025 0.1
大腸桿菌
(ATCC 25922) 0.05 0.1
白色念珠菌
(ATCC 90029) 0.05 0.1

2.3 抑菌曲線的研究結果
繪制仙人掌80%的乙醇提取物和超聲波提取物對金黃色葡萄球菌標準株（ATCC 25923） 和大腸桿菌標準株（ATCC 25922) 的抑菌曲線，結果表明：仙人掌乙醇提取物原液能抑制金黃色葡萄球菌在遲緩期和對數(shù)期的生長以及抑制大腸桿菌在遲緩期的生長（圖4）。

3討論
本研究選用金黃色葡萄球菌為革蘭陽性菌代表，大腸桿菌為革蘭陰性菌代表，選用白色念珠菌為真菌的代表，研究結果表明：仙人掌提取物對試驗中的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌以及真菌均有抑菌活性，仙人掌的乙醇和超聲波提取物對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有較強的抑制作用，但對真菌的抑制作用比前兩種弱。這一結果，在對革蘭氏陽性菌、陰性菌的作用方面是和韓淑琴等人[21]的結果是一致的，但是，與翁佩芳[22]的結果有所不同，對真菌的作用方面，與翁佩芳等人[22]的研究結果一致，與韓淑琴[21]、胡春菊等人[23]的不同。細菌和真菌對仙人掌提取物的敏感性的差異有可能與Kepteyn所說的真菌與細菌在應急機制上有所不同有關[24]。本實驗結果表明，兩種方法所得的仙人掌提取物均有一定的抑菌效果，以80%乙醇提取物的抑菌效果較好，超聲波提取物次之，其原因有待進一步研究。本研究對仙人掌抑菌制品的進一步加工及其在藥用和仙人掌保健品開發(fā)方面提供了實踐依據(jù)。但是在抑菌曲線實驗中，仙人掌乙醇提取物原液能抑制金黃色葡萄球菌在遲緩期和對數(shù)期的生長，但只能抑制大腸桿菌在遲緩期的生長。其原因可能是由于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在代謝機制上的不同有關。仙人掌乙醇提取物原液能抑制金黃色葡萄球菌在遲緩期和對數(shù)期的生長，說明其能抑制金黃色葡萄球菌在遲緩期的大分子前體物質的合成，并能有效抑制其在對數(shù)期細菌的二分裂繁殖。仙人掌乙醇提取物原液只能抑制大腸桿菌在遲緩期的生長，說明其能抑制大腸桿菌在遲緩期的大分子物質的合成，但對大腸桿菌在對數(shù)期的二分裂無抑制效果。

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