作者：2016級(jí)本科生 向彤駿 化學(xué)工程系
指導(dǎo)老師：張翀 化學(xué)工程系
關(guān)鍵詞：米曲霉菌 生物傳感器 高通量篩選
摘要
醬油是中國(guó)傳統(tǒng)的調(diào)味品，其谷氨酸含量對(duì)于其鮮味有重大影響，是衡量醬油優(yōu)劣的重要指標(biāo)。目前我國(guó)使用的醬油釀造菌仍然是1950年的菌種，谷氨酸生產(chǎn)濃度不高。本項(xiàng)目將基于轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別機(jī)制構(gòu)建并建立突變體庫(kù)改造谷氨酸特異性的生物傳感器（Biosensor），使用流式細(xì)胞儀（fluorescence activated Cell Sorting FACS）篩選出特異性最高的傳感器，并將這一傳感器用于微流控篩選（microfluidic screening），篩選出高產(chǎn)谷氨酸的醬油發(fā)酵菌。
項(xiàng)目背景
醬油是中國(guó)傳統(tǒng)的調(diào)味品，主要由大豆、小麥、食鹽經(jīng)過(guò)制油、發(fā)酵等程序釀制而成。因滋味鮮美，有獨(dú)特醬香，常用于增加和改善食品的味道。在醬油的眾多成分中，谷氨酸對(duì)于醬油的鮮味有重大影響，是衡量醬油質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)。
我國(guó)2015年醬油產(chǎn)量980.36萬(wàn)噸，穩(wěn)居世界第一。然而，目前我國(guó)使用的醬油釀造菌仍然是1950年研發(fā)的，時(shí)至今日，在谷氨酸生產(chǎn)等方面已經(jīng)存在落后：發(fā)酵產(chǎn)生的谷氨酸濃度與目前醬油生產(chǎn)技術(shù)最先進(jìn)的日本相比，有5%-10%的差距，品質(zhì)不夠高。
由于醬油屬于食品行業(yè)，對(duì)于安全性有嚴(yán)格的要求，因此不能通過(guò)傳統(tǒng)的基因工程技術(shù)技術(shù)改造發(fā)酵菌，只能夠間接通過(guò)篩選挑出高產(chǎn)谷氨酸的菌種。本項(xiàng)目將借助谷氨酸特異性生物傳感器，配合微流控篩選技術(shù)進(jìn)行高通量篩選，從而盡快得到谷氨酸增產(chǎn)的菌種。但是目前對(duì)特異性的谷氨酸生物傳感器的研究尚未能夠被應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。故要首先開發(fā)出動(dòng)力學(xué)范圍合適的，且特異性高的谷氨酸生物傳感器。
項(xiàng)目設(shè)計(jì)
本項(xiàng)目中我們構(gòu)建了基于嵌合雙組分系統(tǒng)的生物傳感器，將sfGFP基因的表達(dá)強(qiáng)度與谷氨酸濃度建立聯(lián)系，通過(guò)融合來(lái)自Planococcus sp. PAMC 21323的DegS蛋白的感受域，并與具有EnvZ的效應(yīng)域激酶結(jié)合，在Escherichia coli K12 MG1655中構(gòu)建嵌合DegS / EnvZ（DcuSZ）雙組分系統(tǒng)。其中sfGFP基因的表達(dá)由OmpC啟動(dòng)子通過(guò)同源響應(yīng)調(diào)節(jié)因子OmpR介導(dǎo)。此外，通過(guò)修飾啟動(dòng)子和RBS，將構(gòu)建原始生物傳感器突變體庫(kù)，并通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選（FACS）進(jìn)行測(cè)試，以調(diào)節(jié)性能參數(shù)（特異性，動(dòng)力學(xué)范圍，線性區(qū)間等）。
隨后構(gòu)建高通量的微流控篩選系統(tǒng)，首先使用ARTP（常壓室溫等離子體）誘變育種，建立米曲霉菌突變體庫(kù)，再設(shè)計(jì)微流控芯片，如圖所示，使用微流控技術(shù)產(chǎn)生包裹了米曲霉菌單菌的菌液液滴，培養(yǎng)后在芯片內(nèi)與構(gòu)建的生物傳感器混合，再使用FACS（流式熒光細(xì)胞篩選）進(jìn)行熒光檢測(cè)，由于谷氨酸生物傳感器在谷氨酸濃度高時(shí)會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的熒光信號(hào)，就可以利用這一性質(zhì)分選出產(chǎn)生谷氨酸濃度更高的米曲霉菌菌種。
項(xiàng)目成果
我們成功地構(gòu)建了一種生物傳感器菌株，它可以將細(xì)胞外谷氨酸濃度與其sfGFP熒光強(qiáng)度耦合。 該菌株在MOPS基本培養(yǎng)基中顯示出對(duì)外部谷氨酸的線性區(qū)間達(dá)到了預(yù)定的0-2mM，這表明其可用作谷氨酸過(guò)量產(chǎn)生菌株篩選的生物傳感器。但是，它在實(shí)際工作條件下效果不佳。進(jìn)一步的研究將集中在通過(guò)調(diào)整響應(yīng)曲線，例如敲除原生EnvZ / OmpR系統(tǒng)和艱苦篩選等方法進(jìn)行改進(jìn)。
