光響應(yīng)相分離在生化反應(yīng)調(diào)控中的應(yīng)用探究
作者：Tsinghua iGEM 2019團(tuán)隊(duì) (陳泊文 陳春宇 方萌 馮思特 付嘉樂 高吉 黃子康 李佳頤 劉泓睿 盧亙哲 青楚珩 孫立澤 翟紫含 周立群)
指導(dǎo)老師：陳國強(qiáng) 孫之榮 李鵬
關(guān)鍵詞：液液相分離 光敏感 時(shí)間分辨率 酶促反應(yīng)
摘要
細(xì)胞分區(qū)對于高效和有組織的細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)是至關(guān)重要的，然而人工控制特定反應(yīng)在特定細(xì)胞分區(qū)中進(jìn)行仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。本項(xiàng)目利用對光誘導(dǎo)響應(yīng)的蛋白液液相分離作為大腸桿菌中的一個(gè)開關(guān)，以高時(shí)間分辨率的方式將酶組織到不同細(xì)胞區(qū)域中，以操縱細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)。通過依據(jù)液液相分離的特點(diǎn)選取特定底物，并驅(qū)動(dòng)酶進(jìn)出相，我們可以用光控制酶反應(yīng)的整體效率。此外，我們也嘗試了用形態(tài)工程細(xì)胞系解釋在大腸桿菌中形成的液液相分離的原理。并且提出了依據(jù)相分離的空間分布特征調(diào)控更廣泛生命活動(dòng)的潛在應(yīng)用。
【視頻：項(xiàng)目介紹1】【視頻：項(xiàng)目介紹2】【視頻：項(xiàng)目介紹3】
將蛋白質(zhì)的液液相分離引入大腸桿菌
首先，我們將在真核生物中被廣泛研究的蛋白液液相分離現(xiàn)象引入了合成生物學(xué)模式生物大腸桿菌。我們觀察到，在適當(dāng)?shù)鞍妆磉_(dá)強(qiáng)度下，液液相分離成核大約發(fā)生于15分鐘左右，而達(dá)到穩(wěn)定尺寸需要30分鐘左右（圖1）。然后，我們觀察了蛋白質(zhì)液滴在細(xì)菌內(nèi)的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)不同的相分離蛋白在細(xì)菌中形成的分區(qū)在大小達(dá)到穩(wěn)定后數(shù)量和形狀并不相同（圖2）。隨后，我們選擇了其中幾種蛋白質(zhì)液滴，利用熒光漂白恢復(fù)技術(shù)對其流動(dòng)性進(jìn)行了驗(yàn)證，為后續(xù)其它蛋白和小分子進(jìn)出該區(qū)域提供理論支持（圖3）。隨后，我們觀察到了相分離在形態(tài)工程菌（基因組復(fù)制但菌體不分裂）中和DNA相間分布的現(xiàn)象，推測核酸靜電排斥，可能是決定相分離形成位置的主要因素（圖4）。
實(shí)現(xiàn)大腸桿菌內(nèi)蛋白分布對光調(diào)控的響應(yīng)
隨后，我們在相分離骨架蛋白上融合了光響應(yīng)蛋白，使得其在激光照射下能夠與細(xì)胞中其它區(qū)域的另一個(gè)光相應(yīng)蛋白發(fā)生結(jié)合。得益于大腸桿菌內(nèi)部空間有限的優(yōu)勢，在給予光信號后，兩種光響應(yīng)蛋白能夠迅速發(fā)生結(jié)合。在幾秒內(nèi)，原來在菌體彌散分布的光敏蛋白將被招募到預(yù)先形成的蛋白質(zhì)液滴中（圖5）。接著，我們也驗(yàn)證了在停止激光誘導(dǎo)后的十分鐘內(nèi)，被招募的光響應(yīng)蛋白將重新均勻分布到整個(gè)細(xì)胞中。并且該過程可以被反復(fù)誘導(dǎo)。
探究光響應(yīng)蛋白液液相分離對生化反應(yīng)的調(diào)控作用
為了讓細(xì)胞分區(qū)更顯著地增加生化反應(yīng)速率，我們依據(jù)相分離蛋白骨架的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇了可能被富集到蛋白質(zhì)液滴中的底物（主要為帶有π鍵的小分子）。接著，我們觀察了在光照條件下，有（exp）和沒有（ctrl）蛋白質(zhì)液滴的細(xì)胞中的酶促反應(yīng)的速率。發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組中，酶促反應(yīng)速率在酶表達(dá)量較高而底物相對缺乏的情況下能夠被提高1.5倍左右（圖6）。
致謝
我們誠摯感謝三位指導(dǎo)老師，王宣師兄，以及陳心怡、葛霄飛、王庭萱、嚴(yán)齊等iGEM2018隊(duì)員對本項(xiàng)目的指導(dǎo)和幫助。感謝李丕龍老師實(shí)驗(yàn)室和尼康影像中心對本項(xiàng)目提供實(shí)驗(yàn)原料及技術(shù)支持。同時(shí)也感謝生命學(xué)院學(xué)堂班為本項(xiàng)目提供經(jīng)費(fèi)支持。
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