光響應相分離在生化反應調(diào)控中的應用探究
作者：Tsinghua iGEM 2019團隊 (陳泊文 陳春宇 方萌 馮思特 付嘉樂 高吉 黃子康 李佳頤 劉泓睿 盧亙哲 青楚珩 孫立澤 翟紫含 周立群)
指導老師：陳國強 孫之榮 李鵬
關(guān)鍵詞：液液相分離 光敏感 時間分辨率 酶促反應
摘要
細胞分區(qū)對于高效和有組織的細胞內(nèi)活動是至關(guān)重要的，然而人工控制特定反應在特定細胞分區(qū)中進行仍然是一個挑戰(zhàn)。本項目利用對光誘導響應的蛋白液液相分離作為大腸桿菌中的一個開關(guān)，以高時間分辨率的方式將酶組織到不同細胞區(qū)域中，以操縱細胞內(nèi)的生化反應。通過依據(jù)液液相分離的特點選取特定底物，并驅(qū)動酶進出相，我們可以用光控制酶反應的整體效率。此外，我們也嘗試了用形態(tài)工程細胞系解釋在大腸桿菌中形成的液液相分離的原理。并且提出了依據(jù)相分離的空間分布特征調(diào)控更廣泛生命活動的潛在應用。
【視頻：項目介紹1】【視頻：項目介紹2】【視頻：項目介紹3】
將蛋白質(zhì)的液液相分離引入大腸桿菌
首先，我們將在真核生物中被廣泛研究的蛋白液液相分離現(xiàn)象引入了合成生物學模式生物大腸桿菌。我們觀察到，在適當?shù)鞍妆磉_強度下，液液相分離成核大約發(fā)生于15分鐘左右，而達到穩(wěn)定尺寸需要30分鐘左右（圖1）。然后，我們觀察了蛋白質(zhì)液滴在細菌內(nèi)的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)不同的相分離蛋白在細菌中形成的分區(qū)在大小達到穩(wěn)定后數(shù)量和形狀并不相同（圖2）。隨后，我們選擇了其中幾種蛋白質(zhì)液滴，利用熒光漂白恢復技術(shù)對其流動性進行了驗證，為后續(xù)其它蛋白和小分子進出該區(qū)域提供理論支持（圖3）。隨后，我們觀察到了相分離在形態(tài)工程菌（基因組復制但菌體不分裂）中和DNA相間分布的現(xiàn)象，推測核酸靜電排斥，可能是決定相分離形成位置的主要因素（圖4）。
實現(xiàn)大腸桿菌內(nèi)蛋白分布對光調(diào)控的響應
隨后，我們在相分離骨架蛋白上融合了光響應蛋白，使得其在激光照射下能夠與細胞中其它區(qū)域的另一個光相應蛋白發(fā)生結(jié)合。得益于大腸桿菌內(nèi)部空間有限的優(yōu)勢，在給予光信號后，兩種光響應蛋白能夠迅速發(fā)生結(jié)合。在幾秒內(nèi)，原來在菌體彌散分布的光敏蛋白將被招募到預先形成的蛋白質(zhì)液滴中（圖5）。接著，我們也驗證了在停止激光誘導后的十分鐘內(nèi)，被招募的光響應蛋白將重新均勻分布到整個細胞中。并且該過程可以被反復誘導。
探究光響應蛋白液液相分離對生化反應的調(diào)控作用
為了讓細胞分區(qū)更顯著地增加生化反應速率，我們依據(jù)相分離蛋白骨架的結(jié)構(gòu)特點，選擇了可能被富集到蛋白質(zhì)液滴中的底物（主要為帶有π鍵的小分子）。接著，我們觀察了在光照條件下，有（exp）和沒有（ctrl）蛋白質(zhì)液滴的細胞中的酶促反應的速率。發(fā)現(xiàn)在實驗組中，酶促反應速率在酶表達量較高而底物相對缺乏的情況下能夠被提高1.5倍左右（圖6）。
致謝
我們誠摯感謝三位指導老師，王宣師兄，以及陳心怡、葛霄飛、王庭萱、嚴齊等iGEM2018隊員對本項目的指導和幫助。感謝李丕龍老師實驗室和尼康影像中心對本項目提供實驗原料及技術(shù)支持。同時也感謝生命學院學堂班為本項目提供經(jīng)費支持。
項目網(wǎng)頁：https://2019.igem.org/Team:Tsinghua
清新時報專訪：https://mp.weixin.qq.com/s/ywrtwoFaaMzcEIO6FBdkRw
招新推送：https://mp.weixin.qq.com/s/4GIm1jskuizlcYiKlfdH5g
答辯視頻：https://www.bilibili.com/video/av74355497
項目郵箱：igem.thu@outlook.com
