基于CRISPR/Cas12a的AFB1快速檢測技術(shù)
作者：王鴻奎 化工系
指導(dǎo)老師：張翀 化工系
關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas12a Aptamer AFB1 快速檢測
摘要
黃曲霉存在于日常生活中腐爛的各種有機(jī)質(zhì)上，包括米飯、面包、植物油等，呈灰綠色團(tuán)簇狀；其會(huì)產(chǎn)生數(shù)種代謝產(chǎn)物，其中以AFB1毒性最高，被規(guī)定為一類致癌物。現(xiàn)有的檢測手段停留在分析化學(xué)層面，其能耗高、耗時(shí)長、對操作人員要求高等不足使得很難被運(yùn)用到日常居家檢測和食品加工產(chǎn)業(yè)實(shí)時(shí)監(jiān)測。本文開發(fā)了一種基于分子生物學(xué)，利用CRISPR/Cas12a的快速、低成本檢測方法，使得AFB1檢測可以走出實(shí)驗(yàn)室，為更多大眾提供檢測條件。
現(xiàn)有AFB1檢測技術(shù)概述
我國國標(biāo)規(guī)定，對相關(guān)食品中AFB1含量的檢測必須基于TLC、HPLC、LC-MS/MS、ELISA四種方法（圖1），作為傳統(tǒng)的小分子檢測和物質(zhì)鑒定手段，其具有高靈敏度、魯棒性較好、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)由于其繁瑣的前處理步驟和復(fù)雜的儀器應(yīng)用，同樣有檢測過程能耗高、耗時(shí)長、對檢測人員要求高等不足。
分子生物學(xué)概念辨析
CRISPR是被發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌體內(nèi)存在的一種自我防御機(jī)制，當(dāng)遭到病毒侵染時(shí)，其可將該病毒的部分保守序列剪切后插入自己的CRISPR系統(tǒng)中，并將其作為病毒的“名片”；當(dāng)該病毒再次侵染時(shí)，其會(huì)啟動(dòng)自己的酶切機(jī)制，將病毒遺傳序列消解吸收，從而保護(hù)自己不被裂解死亡（圖2）。
Cas蛋白是細(xì)菌防御病毒時(shí)起到識別和剪切作用的一類蛋白，有不同亞型，其可與前導(dǎo)RNA（gRNA）結(jié)合形成復(fù)合物；gRNA有一段長20堿基左右的序列，由于堿基互補(bǔ)配對原則，該段序列可以和特定的識別、待剪切序列結(jié)合，然后激活Cas蛋白的剪切活性，在特定位點(diǎn)剪切被識別序列，起到基因編輯的作用（圖3）。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)選擇兩端分別修飾有熒光-淬滅基團(tuán)的Probe作為信號檢測，而Cas12a恰有非特異性位點(diǎn)，即在剪切目標(biāo)鏈的同時(shí)會(huì)剪切周圍的寡聚核苷酸鏈；當(dāng)未被切割時(shí)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離較近，表現(xiàn)為熒光較弱，反之則強(qiáng)。
Aptamer是一種具有特定二級結(jié)構(gòu)、能與特定小分子等特異性識別并結(jié)合的寡聚核苷酸鏈，其可用SELEX技術(shù)進(jìn)行高通量篩選（圖4）。實(shí)驗(yàn)?zāi)玫搅?span lang="EN-AU">AFB1的aptamer序列，并通過文獻(xiàn)調(diào)研保證了其特異性，但其結(jié)構(gòu)未知，可作為本課題附加成果之一。
實(shí)驗(yàn)原理及總結(jié)
