基于CRISPR/Cas12a的AFB1快速檢測技術(shù)
作者：王鴻奎 化工系
指導(dǎo)老師：張翀 化工系
關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas12a Aptamer AFB1 快速檢測
摘要
黃曲霉存在于日常生活中腐爛的各種有機質(zhì)上，包括米飯、面包、植物油等，呈灰綠色團簇狀；其會產(chǎn)生數(shù)種代謝產(chǎn)物，其中以AFB1毒性最高，被規(guī)定為一類致癌物。現(xiàn)有的檢測手段停留在分析化學(xué)層面，其能耗高、耗時長、對操作人員要求高等不足使得很難被運用到日常居家檢測和食品加工產(chǎn)業(yè)實時監(jiān)測。本文開發(fā)了一種基于分子生物學(xué)，利用CRISPR/Cas12a的快速、低成本檢測方法，使得AFB1檢測可以走出實驗室，為更多大眾提供檢測條件。
現(xiàn)有AFB1檢測技術(shù)概述
我國國標(biāo)規(guī)定，對相關(guān)食品中AFB1含量的檢測必須基于TLC、HPLC、LC-MS/MS、ELISA四種方法（圖1），作為傳統(tǒng)的小分子檢測和物質(zhì)鑒定手段，其具有高靈敏度、魯棒性較好、結(jié)果可靠等優(yōu)點，但同時由于其繁瑣的前處理步驟和復(fù)雜的儀器應(yīng)用，同樣有檢測過程能耗高、耗時長、對檢測人員要求高等不足。
分子生物學(xué)概念辨析
CRISPR是被發(fā)現(xiàn)在細菌體內(nèi)存在的一種自我防御機制，當(dāng)遭到病毒侵染時，其可將該病毒的部分保守序列剪切后插入自己的CRISPR系統(tǒng)中，并將其作為病毒的“名片”；當(dāng)該病毒再次侵染時，其會啟動自己的酶切機制，將病毒遺傳序列消解吸收，從而保護自己不被裂解死亡（圖2）。
Cas蛋白是細菌防御病毒時起到識別和剪切作用的一類蛋白，有不同亞型，其可與前導(dǎo)RNA（gRNA）結(jié)合形成復(fù)合物；gRNA有一段長20堿基左右的序列，由于堿基互補配對原則，該段序列可以和特定的識別、待剪切序列結(jié)合，然后激活Cas蛋白的剪切活性，在特定位點剪切被識別序列，起到基因編輯的作用（圖3）。同時，本實驗選擇兩端分別修飾有熒光-淬滅基團的Probe作為信號檢測，而Cas12a恰有非特異性位點，即在剪切目標(biāo)鏈的同時會剪切周圍的寡聚核苷酸鏈；當(dāng)未被切割時，熒光基團和淬滅基團距離較近，表現(xiàn)為熒光較弱，反之則強。
Aptamer是一種具有特定二級結(jié)構(gòu)、能與特定小分子等特異性識別并結(jié)合的寡聚核苷酸鏈，其可用SELEX技術(shù)進行高通量篩選（圖4）。實驗?zāi)玫搅?span lang="EN-AU">AFB1的aptamer序列，并通過文獻調(diào)研保證了其特異性，但其結(jié)構(gòu)未知，可作為本課題附加成果之一。
實驗原理及總結(jié)
