作者：2017級本科生 王鴻奎 化工系
指導老師：盧元 化工系
關鍵詞：無細胞體系 MOFs 微流控 調(diào)節(jié)
摘要
無細胞體系因為其個性化設計、易于調(diào)控、對毒性不敏感等優(yōu)點在合成生物學領域迅速發(fā)展起來，但就目前來看，大多數(shù)應用仍停留在開放體系的層面，沒有擺脫傳統(tǒng)培養(yǎng)模式的束縛，這也進一步限制了其向更多領域的滲透。本文旨在結(jié)合新材料金屬有機框架（Metal organic frameworks, MOFs）及微流控技術(shù)來探討調(diào)節(jié)無細胞體系蛋白質(zhì)表達水平的基本方法，以求拓寬其的適應性，努力就其與其他領域的交叉和應用提供可能。
引言
近年來，材料科學突飛猛進，諸多成果數(shù)不勝數(shù)，其中最引人注目之一的便是MOFs。作為一種新型材料，其具有極高的孔隙率、巨大的比表面積、良好的化學穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)的可調(diào)控性等諸多優(yōu)點，本文主要是利用其包覆作用來實現(xiàn)限域和減小傳質(zhì)速率的目的。同時，從水凝膠的應用得到啟發(fā)，了解了微流控“極高的傳熱、傳質(zhì)速率，較高的表面效應、易于調(diào)控液體大小”等優(yōu)點，利用了微流控可產(chǎn)生和改變液滴大小的功能探索了油包水結(jié)構(gòu)以及液滴大小對整個無細胞體系的影響。
實驗方法
圖1 整體實驗流程圖解
如圖1所示，本實驗整體分五步進行，分別為：微流控芯片的設計和制備（模型見圖2）、MOFs材料的合成（見圖3）、無細胞體系的制備（見圖4）、微流控芯片的應用、培養(yǎng)及熒光表征。
圖2 微流控芯片模型
如圖2所示，本實驗設計了兩款芯片，主要是考慮流道結(jié)構(gòu)對流體混合和調(diào)控的影響，可產(chǎn)生體積為
以下的微液滴。
圖3 MOFs材料的合成
如圖3所示，本實驗基于MOFs材料ZIF-8的經(jīng)典合成路線，分別嘗試了冷凍干燥和非冷凍干燥兩種模式，探討對無細胞體系表達的影響。
圖4 無細胞體系的制備
如圖4所示，用經(jīng)過優(yōu)化的無細胞體系材料制備無細胞體系，才有熒光蛋白作為報告物質(zhì)，用酶標儀對其后期熒光強度做定量檢測。
實驗結(jié)果討論
圖5 不同培養(yǎng)環(huán)境下蛋白質(zhì)表達水平對比(其中O表示已水洗,S表示未水洗)
圖5表示的是MOFs孔徑大小、加酸、配體離子濃度對熒光蛋白表達的影響(液滴體積
)。通過比較，可知：（1）MOFs的孔徑大小對無細胞體系表達水平有一定影響，具體表現(xiàn)在隨著MOFs孔徑的增大，表達水平也提高；（2）游離的配體離子可能對無細胞體系有較強的毒性作用，且毒性強弱與離子濃度成正相關；（3）加酸與否也會影響蛋白質(zhì)的整體表達。
圖6 不同培養(yǎng)環(huán)境下蛋白質(zhì)表達時間曲線
為了進一步驗證圖5中分析出的諸多影響因素及其內(nèi)部原因，本實驗做了系列實驗，并繪制出了不同培養(yǎng)環(huán)境下的蛋白質(zhì)表達時間曲線，結(jié)果如圖6所示。
圖7 不同液滴大小下蛋白質(zhì)表達對比(含MOFs -不含MOFs)
為進一步探討液滴大小對蛋白質(zhì)表達的影響，本實驗結(jié)合設計的兩款芯片，形成了不同大小的液滴，并在含有MOFs和不含有MOFs兩個不同體系下進行了相應地熒光表征，結(jié)果如圖7所示。從結(jié)果中我們可以明顯的發(fā)現(xiàn)，在不同的體系下，蛋白質(zhì)的表達水平隨液滴大小的變化水平呈現(xiàn)相同的趨勢，表現(xiàn)出
在實驗梯度范圍內(nèi)局部最優(yōu)的狀態(tài)；此結(jié)果表明，液滴的大小確實對蛋白質(zhì)的表達水平有一定影響，但其影響效果成峰形分布，這意味著不同液滴大小中影響因素不單一。
結(jié)論
本研究主要基于新材料MOFs 和微流控技術(shù)，探討了影響蛋白質(zhì)表達的諸多因素，并總結(jié)歸納相關因素，提出相應的調(diào)控蛋白質(zhì)表達水平行之有效的辦法：改變MOFs孔徑大小、調(diào)節(jié)酸性物質(zhì)含量、控制游離配體離子濃度、調(diào)節(jié)氧含量、改變液滴大小等。但由于整個實驗設計試劑眾多，培養(yǎng)環(huán)境多變，蛋白質(zhì)表達呈現(xiàn)出了高度的綜合性，了解清楚每一個因素的影響趨勢及每一個實驗現(xiàn)象背后的科學依據(jù)，需要一定的時間，也從側(cè)面反映了實際體系的復雜性。
