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禽流感是禽類烈性傳染病之一，家禽在感染H9亞型禽流感病毒，特別當(dāng)伴有混合感染時(shí)，可導(dǎo)致并引起高死亡率及產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降。給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失。本作品通過(guò)建立RT-LAMP反應(yīng)體系、結(jié)果可視化技術(shù)研究及臨床應(yīng)用等試驗(yàn)，成功地建立了一種H9亞型禽流感病毒的快速檢測(cè)方法，極大地所淡了診斷耗時(shí)，為該病的早期診斷提供了便利。該方法具有靈敏、簡(jiǎn)單、快速、直觀，無(wú)需復(fù)雜儀器的特點(diǎn)，合適在基層獸醫(yī)中推廣應(yīng)用。

禽流感是禽類烈性傳染病之一，家禽在感染H9亞型禽流感病毒，特別當(dāng)伴有混合感染時(shí)，可導(dǎo)致并引起高死亡率及產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降。給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失。本作品通過(guò)建立RT-LAMP反應(yīng)體系、結(jié)果可視化技術(shù)研究及臨床應(yīng)用等試驗(yàn)，成功地建立了一種H9亞型禽流感病毒的快速檢測(cè)方法，極大地所淡了診斷耗時(shí)，為該病的早期診斷提供了便利。該方法具有靈敏、簡(jiǎn)單、快速、直觀，無(wú)需復(fù)雜儀器的特點(diǎn)，合適在基層獸醫(yī)中推廣應(yīng)用。
本作品經(jīng)敏感性試驗(yàn)，確定RT-LAMP方法比RT-PCR方法敏感性的10倍。兩種方法均有很好的特異性。針對(duì)109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子的檢測(cè)結(jié)果表明，RT-LAMP方法檢出率明顯高于PCR方法。
與傳統(tǒng)RT-PCR方法相比，本作品中使用的RT-LAMP方法不僅具有高敏感性，更為重要的是該方法可極大的節(jié)約檢測(cè)耗時(shí)。傳統(tǒng)RT-PCR需要將樣本RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后再應(yīng)用于檢測(cè)，即使在近年使用較多的一步法RT-PCR，也需在反應(yīng)初期進(jìn)行約30分鐘的反轉(zhuǎn)錄步驟。而RT-LAMP只需在反應(yīng)體系中加入反轉(zhuǎn)錄酶，即可在等溫條件下一步實(shí)現(xiàn)樣本RNA擴(kuò)增，總反應(yīng)僅耗時(shí)60分鐘，較RT-PCR方法節(jié)省至少90分鐘。
RT-LAMP檢測(cè)結(jié)果的判定方法主要分為四類，一是利用凝膠電泳觀察“梯形”條帶的生成，二是使用實(shí)時(shí)濁度儀進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，三是肉眼觀察反應(yīng)管內(nèi)是否產(chǎn)生白色渾濁，四是應(yīng)用熒光顯色劑顯色進(jìn)行判定。但前兩種方法需要特殊試劑與儀器設(shè)備，而利用肉眼觀察渾濁度則存在反應(yīng)管透明度及人為因素等影響結(jié)果的判定。目前有較多的RT-LAMP反應(yīng)使用SYBR Green I 染色劑作為熒光顯色劑，但該熒光顯色劑必須在反應(yīng)結(jié)束后打開(kāi)反應(yīng)管加入，因而易造成核酸氣溶膠污染，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
本作品中使用鈣黃綠素與錳離子的混合溶液作為熒光指示劑，可通過(guò)觀察顏色變化直接判定反應(yīng)結(jié)果。另外，由于整個(gè)反應(yīng)過(guò)程和檢視過(guò)程中不需要開(kāi)蓋，較好地避免了因氣溶膠污染而引起假陽(yáng)性結(jié)果。
除上述內(nèi)容外，本作品還有很大的發(fā)展空間，使其更易于基層使用。例如在此基礎(chǔ)之上，使用FTA卡或沸水浴方法快速提取H9亞型禽流感病毒核酸，可節(jié)省樣本前處理時(shí)間2-3小時(shí)，并且無(wú)需有毒有害試劑與低溫高速離心機(jī)等儀器，操作簡(jiǎn)單。另外，還可對(duì)反應(yīng)試劑的組成與貯存條件進(jìn)行探究?jī)?yōu)化，建立一套較為完善簡(jiǎn)易的H9亞型禽流感診斷試劑盒，推廣至技術(shù)、條件相對(duì)落后的基層實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖場(chǎng)使用。

第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品 省賽二等獎(jiǎng)
1、“H9亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立與熒光顯色劑的應(yīng)用”一文，已于2010年6月被中國(guó)科技核心期刊《農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)》接受，并于2011年第19卷第1期發(fā)表。

2、“H9亞型禽流感病毒快速診斷技術(shù)研究”做為全國(guó)91個(gè)參展項(xiàng)目之一，參加了2010年9月25日由教育部高教司主辦，大連理工大學(xué)承辦的“第三屆全國(guó)大學(xué)生創(chuàng)新論壇”。