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有文獻(xiàn)報(bào)道使用凝血酶親和色譜法分離提取水蛭抗凝血活性成分，但凝血酶親和層析介質(zhì)的最佳制備條件及穩(wěn)定性尚無(wú)文獻(xiàn)進(jìn)行研究。本文研究了凝血酶親和層析介質(zhì)的制備方法。首次以凝血酶活性為指標(biāo)確定了凝血酶親和層析介質(zhì)的最佳制備條件。制備的親和介質(zhì)活性、穩(wěn)定性良好，可在一定時(shí)間內(nèi)反復(fù)使用。本文為凝血酶親和層析介質(zhì)制備提供了參考。 可用于含凝血酶抑制劑的天然藥物篩選、分離和純化。

一種凝血酶親和層析介質(zhì)的制備方法 摘要：對(duì)凝血酶-瓊脂糖親和層析介質(zhì)的制備方法進(jìn)行了研究。首先使用凝血酶和溴化氰活化的瓊脂糖制備凝血酶-瓊脂糖親和層析介質(zhì)，然后用生色底物法考察親和層析介質(zhì)上凝血酶的活性，首次以凝血酶活性為指標(biāo)對(duì)最佳偶聯(lián)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：最佳條件為：使用pH 8.3 Na2CO3-NaHCO3溶液（含0.5 mol/L NaCl）為緩沖溶液，凝血酶用量為每1 g層析介質(zhì)加入凝血酶200 U，室溫反應(yīng)10 h。在最佳條件下所制備的層析介質(zhì)有較好的穩(wěn)定性，在4 ℃條件下存放40天，親和介質(zhì)上的凝血酶活性仍有70.6%保留。該親和層析介質(zhì)可廣泛用于含凝血酶抑制劑的天然藥物篩選和分離純化。 關(guān)鍵詞：凝血酶；親和層析；生色底物法 親和層析（affinity chromatography）是利用生物分子間專一的親和力進(jìn)行分離的色譜技術(shù)。如酶與底物及抑制劑、抗體與抗原、激素與受體之間存在特異性親和作用力，將其中之一作為配基制備固定相，用于色譜分離或者分子間相互作用研究(1)。常見(jiàn)的親和層析類型有：生物親和層析、免疫親和層析、固定化金屬離子親和層析等。親和層析技術(shù)由于特異性強(qiáng)、純化步驟簡(jiǎn)單等被廣泛應(yīng)用于抗原、抗體、抑制劑等的分離純化(2-8)。 以凝血酶為配基進(jìn)行親和層析，可以用于凝血酶直接抑制劑的篩選。文獻(xiàn)曾報(bào)道將凝血酶偶聯(lián)瓊脂糖凝膠作為親和層析介質(zhì)用于水蛭抗凝活性成分篩選，經(jīng)過(guò)凝血酶親和層析介質(zhì)純化后的產(chǎn)品抗凝血酶活性可以達(dá)到7700 U/mg，然而偶聯(lián)條件如：反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH、凝血酶的用量，偶聯(lián)后的親和層析介質(zhì)穩(wěn)定性等卻未見(jiàn)報(bào)道 (9-12)。事實(shí)上，在進(jìn)行偶聯(lián)時(shí)，配基的用量、偶聯(lián)的反應(yīng)條件等將對(duì)親和層析介質(zhì)的性質(zhì)產(chǎn)生重要影響，不恰當(dāng)?shù)呐悸?lián)方法可能引起偶聯(lián)量、偶聯(lián)位點(diǎn)、偶聯(lián)取向不合適或者產(chǎn)生空間位阻等現(xiàn)象(13,14)。因此有必要對(duì)偶聯(lián)條件進(jìn)行控制，目前多通過(guò)分光光度法、酶解法、元素分析法等方法測(cè)定配基的偶聯(lián)量，從而確定偶聯(lián)條件。但親和層析介質(zhì)的好壞應(yīng)該通過(guò)其親和能力來(lái)控制，僅通過(guò)控制偶聯(lián)量來(lái)制備親和層析介質(zhì)，顯然是不夠令人滿意的。本實(shí)驗(yàn)首先采用化學(xué)鍵合的方法將凝血酶偶聯(lián)到溴化氰活化的瓊脂糖上，然后以Chromozym TH為生色底物，考察偶聯(lián)介質(zhì)上凝血酶的活性。首次以凝血酶的活性為指標(biāo)優(yōu)化了反應(yīng)的pH、凝血酶用量等反應(yīng)條件，并對(duì)偶聯(lián)層析介質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為凝血酶抑制劑的篩選以及含有抗凝活性成分天然藥物篩選提供了快速可靠的方法。 1實(shí)驗(yàn)部分 1.1儀器與試劑 TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）。溴化氰活化瓊脂糖凝膠CNBr-activated Sepharose 4B（北京拜耳迪生物技術(shù)有限公司），凝血酶Thrombin（Sigma，T6884，1 KU），生色底物Chromozym TH（Roche）。其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。 1.2 溶液配制 凝血酶溶液的配制：取凝血酶1支（1 KU），加蒸餾水稀釋成10、40、100 U/mL的溶液，分裝保存于-20 ℃冰箱中。 生色底物溶液的配制：精密稱量5.0 mg Chromozym TH，加入4 mL水溶解，分裝保存于-20 ℃冰箱中。 緩沖溶液的配制：分別配制0.1 mol/L的 Na2CO3和NaHCO3溶液（均含0.5 mol/L NaCl），用Na2CO3溶液滴定NaHCO3溶液，調(diào)節(jié)其pH分別為7.8、8.3、9.0、10.0。 1.3 溴化氰活化瓊脂糖凝膠的預(yù)處理 稱取CNBr-activated Sepharose 4B，浸于1 mol/L鹽酸中溶脹，并用1 mol/L HCl抽濾沖洗，按照每1 g凝膠加入200 mL鹽酸的量分批次沖洗凝膠。 1.4生色底物法測(cè)定凝血酶活性 分別取0.5、1、1.5、2、3 μL10 U/mL的凝血酶溶液，加入不同體積的緩沖溶液，使體積為340 μL，混勻，37 ℃溫育2 min后，加入10 μL Chromozym TH溶液，搖勻，37 ℃溫育5 min，加入50 μL 50%（v/v）醋酸溶液終止反應(yīng)，在405 nm下測(cè)定吸光度。 1.5 偶聯(lián)時(shí)間的選擇 將經(jīng)預(yù)處理的CNBr-activated Sepharose 4B加入到pH 8.3的緩沖溶液中，再加入凝血酶溶液，混勻。反應(yīng)過(guò)程中溫和搖動(dòng)反應(yīng)液，每隔2 h，400 r/min離心5 min后，取上清液在280 nm處測(cè)定吸光度，直到吸光度不再降低。 1.6偶聯(lián)pH的選擇 稱取CNBr Sepharose 4B 400 mg，經(jīng)鹽酸預(yù)處理后均分為4等份，分別加入500 μLpH 7.8、8.3、9.0、10.0的緩沖溶液，然后按照每1 g干凝膠加入100 U配基的量加入凝血酶溶液，室溫下振蕩反應(yīng)10 h。反應(yīng)液400 r/min離心5 min后，棄去上清液，下層凝膠用大量的pH 8.3的緩沖溶液反復(fù)清洗數(shù)次。將不同pH條件下偶聯(lián)得到的凝膠轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，用pH 8.3的緩沖溶液定容，搖勻后，取出20 μL，加入320 μL pH 8.3的緩沖溶液，按照1.4項(xiàng)下操作進(jìn)行生色底物反應(yīng)，反應(yīng)液離心后上清液在405 nm下測(cè)定吸光度。 1.7偶聯(lián)酶量的選擇 稱取CNBr-Sepharose 4B 500 mg，經(jīng)鹽酸預(yù)處理后，均分為5份，加入pH 8.3的緩沖液，按照每1 g干凝膠加入100、200、400、600、1000 U配基的量加入凝血酶溶液。室溫下振蕩反應(yīng)10 h。反應(yīng)液按1.6項(xiàng)下操作進(jìn)行清洗、定容，并進(jìn)行生色底物反應(yīng)測(cè)定吸光度。 1.8 偶聯(lián)凝血酶穩(wěn)定性考察 按照加酶量為200 U/g，在pH 8.3的緩沖溶液中，按照1.6項(xiàng)下操作制備凝血酶偶聯(lián)瓊脂糖層析介質(zhì)，最后用pH 8.3的緩沖溶液定容于5 mL的容量瓶，4 0C保存。按生色底物法操作，每隔5天取出一部分測(cè)定凝血酶的活性，考察凝血酶偶聯(lián)瓊脂糖層析介質(zhì)的穩(wěn)定性。 2結(jié)果與討論 2.1生色底物法測(cè)定凝血酶活性線性考察 凝血酶與其底物Chromozym TH反應(yīng)生成的產(chǎn)物對(duì)硝基苯胺，在405 nm處有吸收。在底物濃度過(guò)量情況下，405 nm處的吸光度應(yīng)與凝血酶的用量成正比。實(shí)驗(yàn)中考察了凝血酶（10 U/mL）加入量在0.5-5 μL范圍內(nèi)變化時(shí)吸光度變化情況，結(jié)果表明當(dāng)凝血酶的加入量在0.5-3 μL范圍內(nèi)，即5*10-3-30*10-3U范圍內(nèi)時(shí)，吸光度隨凝血酶加入量線性增加，線性回歸方程為Y=0.0148X-0.018 。繼續(xù)增大凝血酶的加入量至4或5 μL時(shí)，吸光度值不再線性增加。 2.2偶聯(lián)時(shí)間的選擇 凝血酶與瓊脂糖介質(zhì)偶聯(lián)后，反應(yīng)液經(jīng)離心，上清液中游離的凝血酶減少，A280降低，完全反應(yīng)后，A280不再改變，從而確定反應(yīng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，凝血酶與CNBr -Sepharose 4B偶聯(lián)反應(yīng)速度較快，0-4 h內(nèi)吸光度迅速降低，反應(yīng)6 h后吸光度值不再明顯下降，為保證完全反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)至10 h。 2.3偶聯(lián)pH條件的選擇 偶聯(lián)反應(yīng)pH值，一方面影響凝血酶的活性，另一方面會(huì)影響偶聯(lián)量及偶聯(lián)位點(diǎn)等。實(shí)驗(yàn)中考察了pH在7.8-10.0之間變化時(shí)對(duì)親和層析介質(zhì)的影響，并用生色底物法測(cè)定了不同pH條件下層析介質(zhì)上凝血酶的活性。當(dāng)pH為7.8、8.3和9.0時(shí)生色反應(yīng)所測(cè)得的吸光度值無(wú)明顯變化。可能是由于凝血酶的活性范圍是pH 5.0-10.0( 8.3為最佳pH)，在該pH范圍內(nèi)，凝血酶活性基本不受影響。且反應(yīng)結(jié)束后將親和層析介質(zhì)置于pH 8.3的緩沖液中，恢復(fù)了其最佳pH條件，因此測(cè)定的活性相差不大，而pH為10.0時(shí)，凝血酶在該條件下不穩(wěn)定，即使反應(yīng)后將pH恢復(fù)至最佳，凝血酶的活性也不可再恢復(fù)。 2.4偶聯(lián)酶量的選擇 配基用量是制備親和層析介質(zhì)時(shí)的重要參數(shù)。酶用量過(guò)低時(shí)會(huì)造成偶聯(lián)配基活力不足和層析介質(zhì)的浪費(fèi)；酶用量過(guò)高時(shí)，可能造成偶聯(lián)位點(diǎn)過(guò)多、偶聯(lián)取向不合適或者形成空間位阻等，導(dǎo)致配基親和能力降低或者配基的浪費(fèi)。實(shí)驗(yàn)中考察了凝血酶用量在100-1000 U/g變化時(shí)，親和層析介質(zhì)對(duì)生色反應(yīng)的影響。當(dāng)凝血酶用量從100 U/g增加到200 U/g時(shí)，吸光度及偶聯(lián)凝血酶的活性顯著增加；而從200 U/g增加到1000 U/g時(shí)，吸光度及偶聯(lián)凝血酶的活性也在逐漸增加，但增加趨勢(shì)緩慢，而回收率卻明顯降低?？赡苁怯捎谀赣昧枯^高時(shí)，由于反應(yīng)位點(diǎn)不足、空間位阻等原因，造成偶聯(lián)凝血酶的活性增加緩慢，使大部分凝血酶未與層析介質(zhì)偶聯(lián)，回收率降低。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，凝血酶用量控制在200 U/g為合適的配基用量，這與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的151 U/g基本吻合(12)。 2.5凝血酶親和層析介質(zhì)穩(wěn)定性考察 在選定的最優(yōu)條件下，利用生色底物法測(cè)定偶聯(lián)凝血酶層析介質(zhì)的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖3所示。在測(cè)定的時(shí)間內(nèi)，所測(cè)得的吸光度值逐漸降低，表明凝血酶的活性逐漸降低，但下降趨勢(shì)比較緩慢，40天時(shí)偶聯(lián)瓊脂糖凝膠上的凝血酶活性仍有最初制備時(shí)的70.6%。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，凝血酶的水溶液在常溫下24 h就會(huì)完全失活(15)，將凝血酶偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠后，凝血酶的穩(wěn)定性得到很大提高，因此所合成的凝血酶親和層析介質(zhì)可以在一定的時(shí)間內(nèi)反復(fù)使用。 3結(jié)論 本文制備了凝血酶-瓊脂糖親和層析介質(zhì)，用生色底物法考察了親和層析介質(zhì)上凝血酶的活性，并以凝血酶活性為指標(biāo)篩選出了最佳的偶聯(lián)條件。此外，該凝血酶親和層析介質(zhì)有較好的穩(wěn)定性，可以在一定時(shí)期內(nèi)反復(fù)使用。所制備的凝血酶親和層析介質(zhì)可用于凝血酶抑制劑的篩選、分離純化。 參考文獻(xiàn)： 1. 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獲得第七屆“挑戰(zhàn)杯”首都大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽二等獎(jiǎng)