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基本信息
- 作品名稱(chēng)：
- 人骨形態(tài)發(fā)生蛋白4成熟肽序列在畢赤酵母中的高效表達(dá)、純化和活性檢測(cè)
- 大類(lèi)：
- 自然科學(xué)類(lèi)學(xué)術(shù)論文
- 小類(lèi)：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
根據(jù)畢赤酵母高表達(dá)基因?qū)μ囟艽a子偏好的特性，選擇畢赤酵母高表達(dá)基因偏好的密碼子，替換人BMP-4成熟肽序列在畢赤酵母高表達(dá)基因中不常用的密碼子，優(yōu)化設(shè)計(jì)人BMP-4成熟肽表達(dá)序列并構(gòu)建重組表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌和篩選高表達(dá)菌株；利用色譜純化技術(shù)設(shè)計(jì)純化路線，純化重組人BMP-4；對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行生理活性檢測(cè)。
- 詳細(xì)介紹：
目的：骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（Bone morphogenetic protein 4，BMP4）是一種生長(zhǎng)因子，具有明顯促進(jìn)細(xì)胞組織分化為骨組織的能力，在骨缺損、骨折的修復(fù)和脊柱融合等眾多方面的骨科臨床上有很高的應(yīng)用價(jià)值。從哺乳動(dòng)物骨骼材料中提取的天然BMP-4數(shù)量有限、成本高、且具有免疫源性，限制了其在臨床上的應(yīng)用。為此，我們建立了人BMP-4在畢赤酵母中的高效表達(dá)及純化工藝。 方法：根據(jù)畢赤酵母高表達(dá)基因?qū)μ囟艽a子偏好的特性，選擇畢赤酵母高表達(dá)基因偏好的密碼子，替換人BMP-4成熟肽序列在畢赤酵母高表達(dá)基因中不常用的密碼子，優(yōu)化設(shè)計(jì)人BMP-4成熟肽表達(dá)序列并構(gòu)建重組表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌和篩選高表達(dá)菌株；利用色譜純化技術(shù)設(shè)計(jì)純化路線，純化重組人BMP-4；對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行生理活性檢測(cè)。 結(jié)果：控制表達(dá)序列A+T含量在30-55%的范圍內(nèi)，盡可能使用畢赤酵母高表達(dá)基因偏好的密碼子，優(yōu)化設(shè)計(jì)人BMP-4表達(dá)序列，使人BMP-4的表達(dá)水平提高了4倍，在搖瓶表達(dá)中產(chǎn)量能達(dá)到48mg/L。發(fā)酵上清中的重組人BMP-4用SP Sepharose和heparin親和色譜層析法進(jìn)行純化。對(duì)純化后的人BMP-4進(jìn)行生理活性的檢測(cè)，結(jié)果顯示重組人BMP-4能異位誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的生成和增加效應(yīng)細(xì)胞的堿性磷酸酶的活性，具有生理活性。 結(jié)論：通過(guò)對(duì)人BMP-4表達(dá)序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)，有效地解決了人BMP-4在畢赤酵母中表達(dá)量低的問(wèn)題，同時(shí)建立了重組人BMP4純化工藝，并證明畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)的人重組BMP-4具有明顯的生理活性，為人BMP-4進(jìn)一步的臨床應(yīng)用開(kāi)發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。
- 獲獎(jiǎng)情況：
第十二屆“挑戰(zhàn)杯”作品 三等獎(jiǎng)
無(wú)