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本課題探討血管內(nèi)皮生長抑制因子（VEGI-192）的結(jié)構(gòu)和功能學(xué)關(guān)系，首次發(fā)現(xiàn)VEGI-192蛋白具有形成多聚體空間結(jié)構(gòu)的特性；通過體內(nèi)、體外抗血管新生實驗，證明了VEGI-192蛋白多聚體的結(jié)構(gòu)形式可能為其生物學(xué)活性形式；同時以整合素αvβ3為腫瘤靶點，RGD-4C肽為腫瘤靶向載體，VEGI-192蛋白為抗腫瘤效應(yīng)分子，成功構(gòu)建靶向性抗腫瘤融合蛋白RGD-VEGI-192。

本課題組成員自2008年開始研究一種更加高效穩(wěn)定的蛋白表達系統(tǒng)和純化復(fù)性方法，目前已成功建立VEGI-192蛋白的新型自動誘導(dǎo)原核表達系統(tǒng)及蛋白制備新工藝，并能高效穩(wěn)定地表達高產(chǎn)量、高純度、高活性及可溶性好的VEGI-192重組蛋白。因為本系統(tǒng)自身的獨特設(shè)計，可以為重組蛋白在宿主菌中提供均衡氧化還原勢能，以利于蛋白的正確空間折疊，應(yīng)用該自動誘導(dǎo)系統(tǒng)表達的VEGI-192重組蛋白在產(chǎn)量、可溶性、活性等方面均明顯優(yōu)于傳統(tǒng)IPTG誘導(dǎo)表達系統(tǒng)。而在蛋白純化過程中，通過Western blotting檢測方法比較兩個系統(tǒng)獲得的VEGI-192重組蛋白條帶的異同，我們發(fā)現(xiàn)自誘導(dǎo)系統(tǒng)存在的豐富的多聚體形態(tài)，于是，我們提出一個假設(shè)：VEGI-192蛋白具有形成多聚體空間結(jié)構(gòu)的特性，并且研究證明這種多聚體的結(jié)構(gòu)形式可能為其生物學(xué)活性形式。

我們發(fā)現(xiàn)，進行非還原SDS-PAGE后再進行Western Blotting檢測來進一步分析鑒定自誘導(dǎo)表達系統(tǒng)純化的VEGI-192蛋白，有兩條蛋白條帶清晰可見，我們推測這很可能便是VEGI-192的多聚體條帶。為了進一步驗證排除非特異條帶的可能性，我們充分煮沸使VEGI-192變性后再次進行Western Blotting分析，結(jié)果顯示無多聚體蛋白條帶，這從一方面面證明了VEGI-192存在多聚體的結(jié)構(gòu)形式。同時，我們將VEGI-192用非還原SDS-PAGE后再進行考馬斯亮藍染色，切下處于上方的多聚體條帶作質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示該條帶即為VEGI-192蛋白，這充分證明了VEGI-192存在多聚體的結(jié)構(gòu)形式。目前我們正開展對VEGI-192蛋白的結(jié)晶實驗，擬進行X-射線晶體衍射實驗對其多聚體結(jié)構(gòu)進行更為詳盡的鑒定。

我們發(fā)現(xiàn)了自誘導(dǎo)系統(tǒng)制備的重組蛋白的多聚體量更多，進而通過采用MTT比色試驗法和Annexin V細胞染色分析結(jié)合流式細胞術(shù)檢測VEGI-192重組蛋白在不同多聚體形態(tài)下的體外抑制內(nèi)皮細胞增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡的生物學(xué)活性。同時應(yīng)用雞胚絨毛尿囊血管新生抑制實驗測定兩者體內(nèi)抑制血管新生活性，我們發(fā)現(xiàn)多聚體含量越高的VEGI-192重組蛋白其抗血管新生的生物學(xué)活性更強。這充分證明VEGI-192蛋白形成的多聚體的空間結(jié)構(gòu)可能為其生物學(xué)活性形式。

同時在VEGI-192蛋白的結(jié)構(gòu)改造與修飾方面，我們引入RGD多肽與VEGI-192形成嵌合蛋白，擬探討RGD的嵌合改造是否能增強VEGI-192的功效。RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，作為整合素和其配體相互作用的識別位點, 介導(dǎo)細胞與細胞外基質(zhì)及細胞之間的相互作用。腫瘤細胞或者新生血管可以特異表達某些整合素如αvβ3，能以一定的親和力結(jié)合RGD肽,成為腫瘤治療的新靶點。因此,RGD 肽在腫瘤治療中的應(yīng)用已成為研究熱點。RGD肽可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而且作為載體在腫瘤靶向治療中發(fā)揮重要作用。而目前在VEGI蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)、作用機理和藥理學(xué)性質(zhì)沒有完整清晰的了解的情況下，我們擬構(gòu)建靶向性更強的嵌合重組蛋白RGD-VEGI-192，以整合素αvβ3為腫瘤靶點，RGD-4C肽為腫瘤靶向載體，VEGI-192蛋白為抗腫瘤效應(yīng)分子，構(gòu)建靶向性抗腫瘤融合蛋白RGD-VEGI-192，并檢測其生物學(xué)活性，為深入探討RGD-VEGI-192的體內(nèi)靶向抑瘤活性及腫瘤治療應(yīng)用前景奠定基礎(chǔ)。同時豐富了VEGI-192在腫瘤治療中的應(yīng)用形式，為腫瘤靶向治療提供了新思路。

第十二屆“挑戰(zhàn)杯”作品 一等獎
1.本論文部分結(jié)果已發(fā)表于SCI雜志《Protein Science》，影響因子2.9，本課題組成員劉漢凝同學(xué)為共同第一作者。
2.本課題組構(gòu)建的VEGI-192蛋白的新型自動誘導(dǎo)原核表達系統(tǒng)及蛋白制備新工藝的專利申請已獲國家知識產(chǎn)權(quán)局予以受理，申請?zhí)枮?00910037702.6。
3.本課題組構(gòu)建的靶向性抗腫瘤融合蛋白RGD-VEGI-192表達克隆專利申請已獲國家知識產(chǎn)權(quán)局予以受理，申請?zhí)枮?00910037701.1。
4.本作品獲我校第十一屆“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)作品大賽一等獎。
5.本作品獲廣東省第十一屆“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)作品大賽特等獎。