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基本信息
- 項目名稱：
- 東北高山地區(qū)蘇云金芽孢桿菌的分離及其cry基因克隆
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 生物殺蟲劑是一類新型的綠色殺蟲劑，我國物產(chǎn)富饒，菌種資源豐富。尤其是以東北地區(qū)的黑土地菌種資源更是分布龐大，蘇云金芽孢桿菌出土率較高，且地區(qū)之間差異較大，比較容易分出多種不同的殺蟲蛋白。正是如此我們采集了密山、綏化、丹東、五指山地區(qū)的土樣。通過鑒定起基因型，以研究東北高山地區(qū)蘇云金芽孢桿菌的分布。
- 詳細(xì)介紹：
- 蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是一類分布廣泛并能產(chǎn)生多種殺蟲蛋白的革蘭氏陽性細(xì)菌，很多國家都投入大量資金研究其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。不少殺蟲基因都已被大量表達(dá)并且應(yīng)用于新型的生物農(nóng)藥，從根本上解決了傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥污染環(huán)境和害蟲產(chǎn)生抗藥性的問題。我國物產(chǎn)富饒，菌種資源豐富。尤其是以東北地區(qū)的黑土地菌種資源更是分布龐大，蘇云金芽孢桿菌出土率較高，且地區(qū)之間差異較大，比較容易分出多種不同的殺蟲蛋白。 正是如此我們采集了密山、綏化、丹東、五指山地區(qū)的土樣。通過4%的氯化鈉培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)法、高溫篩選法和油鏡鏡檢綜合法，分離了每個地區(qū)的蘇云金芽孢桿菌菌株若干，并在油鏡下觀察了每個菌株形成的伴孢晶體蛋白。使用通用引物進(jìn)行PCR，鑒定其cry基因類型。 最終我們采集土樣共計70份，分離的蘇云金芽孢桿菌35株，在油鏡下觀察到伴孢晶體類型有菱形、球形、方形、以及晶體與芽孢粘連的特殊類型。通過PCR分析鑒定，含有cry1型基因的菌株1株，含有cry3型基因的菌株2株。進(jìn)行蘇云金芽孢桿菌全基因序列的克隆與表達(dá)，測定了一株含cry3高效殺蟲蛋白的全基因堿基序列、氨基酸序列。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 生物殺蟲劑是一類新型的綠色殺蟲劑，我國物產(chǎn)富饒，菌種資源豐富。尤其是以東北地區(qū)的黑土地菌種資源更是分布龐大，蘇云金芽孢桿菌出土率較高，且地區(qū)之間差異較大，比較容易分出多種不同的殺蟲蛋白。正是如此我們采集了密山、綏化、丹東、五指山地區(qū)的土樣。通過鑒定起基因型，以研究東北高山地區(qū)蘇云金芽孢桿菌的分布。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 本研究采用溫度篩選方法篩選菌株，采用4%的氯化鈉培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)，有效地抑制Bt孢子的萌發(fā)。通過石炭酸復(fù)紅染色鏡檢初步鑒定，并結(jié)合晶體形態(tài)伴孢晶體的鑒定蘇云金桿菌。對Bt分離菌株的cry基因進(jìn)行PCR-RFLP鑒定，及蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白的SDS-PAGE分析。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 應(yīng)用化學(xué)合成制劑控制害蟲，雖然在大多數(shù)情況下是有效的,但是化學(xué)藥物有很多負(fù)面影響,如容易使第二代昆蟲產(chǎn)生抗藥性,對其他物種的毒害,環(huán)境污染,農(nóng)產(chǎn)品和動物中有殘留.。本研究的鑒定方法對蘇云金芽孢桿菌的資源分布，高效篩選優(yōu)良和含有新型基因的菌株，以及基因克隆、構(gòu)建工程菌并對獲得抗蟲轉(zhuǎn)基因植物具有十分重要的理論和實踐意義。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是一類分布廣泛并能產(chǎn)生多種殺蟲蛋白的革蘭氏陽性細(xì)菌。不少殺蟲基因都已被大量表達(dá)并且應(yīng)用于新型的生物農(nóng)藥，從根本上解決了傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥污染環(huán)境和害蟲產(chǎn)生抗藥性的問題。我國物產(chǎn)富饒，菌種資源豐富。尤其是以東北地區(qū)的黑土地菌種資源更是分布龐大，蘇云金芽孢桿菌出土率較高，且地區(qū)之間差異較大，比較容易分出多種不同的殺蟲蛋白。 正是如此我們采集了密山、綏化、丹東、海南五指山地區(qū)的土樣。通過4%的氯化鈉培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)法、高溫篩選法和油鏡鏡檢綜合法，分離了每個地區(qū)的蘇云金芽孢桿菌菌株若干，并在油鏡下觀察了每個菌株形成的伴孢晶體蛋白。使用通用引物進(jìn)行PCR，鑒定其cry基因類型。 最終我們采集土樣共計70份，分離的蘇云金芽孢桿菌35株，在油鏡下觀察到伴孢晶體類型有菱形、球形、方形、以及晶體與芽孢粘連的特殊類型。通過PCR分析鑒定，含有cry1型基因的菌株1株，含有cry3型基因的菌株2株。進(jìn)行蘇云金芽孢桿菌全基因序列的克隆與表達(dá)，測定了一株含cry3高效殺蟲蛋白的全基因堿基序列、氨基酸序列。
獲獎情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 情況屬實
參考文獻(xiàn)
- 2004年9月11日，美國能源部的Brettin等在NCBI上公布了一株名為97-27的蘇云金芽孢桿菌的基因組全序列，標(biāo)志著人類對Bt由單個基因研究向基因組研究時代的開始。 2005年，羅蘭，謝丙炎等（羅蘭，謝丙炎 2005）曾從我國20個省市采集176份土壤中分離出蘇云金芽孢桿菌51株. 以cry1, cry2, cry3, cry4, cry - n, cry7, cry8,cry11, cry13和cyt的引物作PCR分析.對我國蘇云金芽孢桿菌菌種資源的分布做了一個較為詳細(xì)的調(diào)查。 2008年，張靈玲，關(guān)怡等對武夷山的5 份土壤樣本進(jìn)行蘇云金芽孢桿菌菌株的分離,獲得2 株編號分別為QQ3 和QQ17的Bt 新菌株。并做了生物活性測試，發(fā)現(xiàn)QQ17 對白紋伊蚊有很高的殺蟲活性,校正死亡率達(dá)95.6%，使生物殺蚊劑的開發(fā)研制成為了可能（張靈玲，關(guān)怡， 2008）。同年，張靈玲，張永嶸等對生物農(nóng)藥Bt資源庫進(jìn)行了初步構(gòu)建并研究了Bt菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化特性,以及相關(guān)菌株的基因情況（張靈玲，張永嶸， 2008）。為保護(hù)有益生物菌株和生物農(nóng)藥的研制做出了重要貢獻(xiàn)。
同類課題研究水平概述
- 1901年日本學(xué)者S.Ishiwata從猝倒死亡的家蠶體內(nèi)分離出一種桿狀細(xì)菌，即Bt猝倒亞種(Bacillus thuringiensis subsp. scotto)，從而揭開了人類對蘇云金芽孢桿菌的研究史（Ishiwata S，1901）。 1911年Berliner報道了從德國蘇云金省染病的地中海粉螟中分離出一種桿菌并定名為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)（Berliner E，1911）。 1938年，第一個蘇云金芽孢桿菌商品制劑問世，用于防治地中海粉螟。到1953年Hannay第一次發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌的殺蟲活性與伴孢晶體有關(guān)，并與Fitz-James一起證實了伴孢晶體是一種蛋白質(zhì)（Hannay C L，1953; Hannay C L et al，1955）。Dulmage（1970）篩選出對夜蛾科毒力較高的菌株HD-1，并以此建立了標(biāo)準(zhǔn)品的生物測定程序，實現(xiàn)了蘇云金芽孢桿菌制劑的標(biāo)準(zhǔn)化（Dulmage H T，1970）。 1995年Crickmore等提出了新的cry基因分類系統(tǒng)，目前確定并公布的殺蟲基因已達(dá)325種。（截至2005年1月）（）。 2005年，羅蘭，謝丙炎等（羅蘭，謝丙炎 2005）曾從我國20個省市采集176份土壤中分離出蘇云金芽孢桿菌51株. 以cry1, cry2, cry3, cry4, cry - n, cry7, cry8,cry11, cry13和cyt的引物作PCR分析.對我國蘇云金芽孢桿菌菌種資源的分布做了一個較為詳細(xì)的調(diào)查。 2008年，張靈玲，關(guān)怡等對武夷山的5 份土壤樣本進(jìn)行蘇云金芽孢桿菌菌株的分離,獲得2 株編號分別為QQ3 和QQ17的Bt 新菌株。并做了生物活性測試，發(fā)現(xiàn)QQ17 對白紋伊蚊有很高的殺蟲活性,校正死亡率達(dá)95.6%，使生物殺蚊劑的開發(fā)研制成為了可能（張靈玲，關(guān)怡， 2008）。同年，張靈玲，張永嶸等對生物農(nóng)藥Bt資源庫進(jìn)行了初步構(gòu)建并研究了Bt菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化特性,以及相關(guān)菌株的基因情況（張靈玲，張永嶸， 2008）。為保護(hù)有益生物菌株和生物農(nóng)藥的研制做出了重要貢獻(xiàn)。
