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基本信息
- 項目名稱：
- 青蒿琥酯對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎IL-17影響的研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本研究以膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠為模型，觀察青蒿琥酯調(diào)控細(xì)胞免疫功能，抑制關(guān)節(jié)破壞的作用，通過檢測T細(xì)胞活化分子CD3、CD71水平,IL-2基因表達(dá)，IL-17蛋白和基因表達(dá)，RANKL/OPG蛋白和基因表達(dá)，分析CIA關(guān)節(jié)炎癥和骨質(zhì)破壞情況，闡明青蒿琥酯通過抑制T細(xì)胞活化減輕關(guān)節(jié)炎癥的作用機理，本課題將為揭示青蒿琥酯治療RA的內(nèi)涵提供實驗依據(jù)，并拓展其治療RA等自身免疫性疾病的臨床應(yīng)用。
- 詳細(xì)介紹：
- 1．研究意義與目的，同類研究工作國內(nèi)外研究現(xiàn)狀與存在的問題等 1.國內(nèi)外同類研究現(xiàn)狀與存在的問題（研究背景）： 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以慢性多關(guān)節(jié)滑膜炎、骨及軟骨破壞為主要特征的全身性自身免疫性疾病，其主要標(biāo)志是滑膜中白細(xì)胞浸潤。這種炎癥過程能夠刺激抗凋亡成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）的增殖，直接導(dǎo)致形成血管翳和關(guān)節(jié)損傷以及關(guān)節(jié)內(nèi)致炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。RA的發(fā)病率在我國約為0.4%，全球為0.5%-1.0%。該病兩年致殘率高達(dá)50%，患者生命普遍減少5到10年，致死率高，且每年有大量的患者未得到規(guī)范的治療[1]，因此，開發(fā)針對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的有效藥物迫在眉睫。 目前臨床藥物中，甲氨蝶呤(methotrexate ，MTX)是最經(jīng)典的一種細(xì)胞毒免疫抑制藥，價格低廉，是應(yīng)用范圍比較廣的的二線抗風(fēng)濕藥，起效較慢，可以延緩炎癥對關(guān)節(jié)的破壞，但是不能完全阻止骨質(zhì)破壞，效益/毒性欠滿意，常見胃腸道反應(yīng)，肝功能損害等副作用；雷公藤是一種被廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的中藥。研究表明，雷公藤多苷能改善大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎病情，但雷公藤根、莖、葉均有巨毒，臨床上，可以引起消化道、血液系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的多系統(tǒng)不良反應(yīng)；生物制劑是近年來得到研究和臨床應(yīng)用的治療RA的新手段，具有特異性阻斷免疫反應(yīng)的特點，療效明顯，但是其價格高昂，患者難以承受，而且有發(fā)生感染和腫瘤的可能性，其治療RA的大規(guī)模應(yīng)用還有待考察[2]。 相比之下，臨床多年治療瘧疾等疾病的青蒿，療效明顯，毒副作用低，過敏反應(yīng)較少見，青蒿素及其衍生物已被WHO批準(zhǔn)為在世界范圍內(nèi)治療重癥和氯喹抵抗瘧疾的首選藥物[3]。青蒿琥酯(artesuante，ART)是青蒿素的水溶性半琥珠酸酯衍生物，研究表明，除了抗瘧作用外，ART還影響一系列細(xì)胞內(nèi)生化過程，包括免疫調(diào)節(jié)以及抗炎、抗血管生成等，而免疫調(diào)節(jié)異常、滑膜炎癥與新生血管形成在RA的發(fā)病機制中均具有重要作用[4]。張長城等[5]實驗證明青蒿琥酯和甲氨蝶呤都能抑制培養(yǎng)的膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞增生，可以阻止TNF-α，IL-1β等細(xì)胞因子的分泌；崔向軍等[6]在使用潑尼松片及甲氨蝶呤的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用青蒿琥酯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎50例，經(jīng)觀察各項臨床指標(biāo)得到較好恢復(fù)，與羥氯喹比較療效相當(dāng)，說明青蒿琥酯對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用不亞于羥氯喹；和雅等[3]實驗以牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠為模型，證明ART明顯改善CIA大鼠一般情況、關(guān)節(jié)腫脹以及關(guān)節(jié)滑膜病理改變，提示青蒿琥酯對實驗性RA有良好的治療作用。臨床研究表明ART對RA具有治療作用，但其作用機制尚不清楚，目前這方面的研究國內(nèi)外仍處于起步階段。 IL-17蛋白含有155個氨基酸，分子質(zhì)量為35 ku，是一個由二硫鍵連接的同源二聚體組成的糖蛋白，主要由外周活化的CD4+記憶性T淋巴細(xì)胞亞群和CD8+記憶性T淋巴細(xì)胞中的CD45RO+亞群受刺激后分泌。研究表明，IL-17在局部組織炎癥中的作用，主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞釋放前炎癥因子及動員中性粒細(xì)胞的細(xì)胞因子而發(fā)揮作用[7]。 研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病程發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。RA患者的關(guān)節(jié)滑膜中浸潤的T細(xì)胞表達(dá)IL-17，患者血清和滑膜液中的IL一17水平上升，同時伴有IL-15水平的上升。IL-17可以通過刺激滑膜細(xì)胞表達(dá)分泌角質(zhì)細(xì)胞生長因子(keratinocyte grownl factor，KGF)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、和肝素結(jié)合性表皮生長因子(heparin-binding epidemal growth factor-likegrowth factor，HB-EGF)等血管因子促進(jìn)血管翳的形成，在RA的早期即發(fā)揮破壞作用；其能誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞表達(dá)金屬蛋白酶，使蛋白多糖分子斷裂，破壞軟骨組織；同時IL-17通過對RANKL/RANK/OPG平衡系統(tǒng)產(chǎn)生影響，在骨質(zhì)破壞反應(yīng)中對破骨細(xì)胞的活化和骨質(zhì)的吸收方面發(fā)揮著重要作用[7]。RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)是近年來發(fā)現(xiàn)的在破骨細(xì)胞分化過程中一個重要信號傳導(dǎo)通路，包括RANKL（Ligand of receptor activator of NF-κB），或稱為破骨細(xì)胞分化因子（Osteoclast differentiation factor，ODF）；其位于破骨細(xì)胞細(xì)胞膜上的受體RANK（Receptor activator of NF-κB）和RANKL的假陽性受體骨保護(hù)素（Osteoprotegerin,OPG）。成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)RANKL，與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞或破骨細(xì)胞表面上的RANK結(jié)合后，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化與骨吸收活性。成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌表達(dá)OPG與RANKL競爭性結(jié)合，阻止RANKL與RANK之間的結(jié)合，從而達(dá)到一個RANKL/RANK/OPG平衡狀態(tài)。研究認(rèn)為RANKL/RANK/OPG平衡與破骨過程直接相關(guān)，該平衡的打破可導(dǎo)致骨質(zhì)的破壞，而IL-17表達(dá)水平的上升將對RANKL/RANK/OPG平衡產(chǎn)生影響，從而引發(fā)骨質(zhì)破壞[8]。此外Kirkham等[9]對IL-1B、IL-10、IL-16、IL-17、RANKL、TNF-α、IFN-1等滑膜細(xì)胞因子能否作為RA關(guān)節(jié)損傷進(jìn)展的檢測指標(biāo)進(jìn)行了2年的前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-10、IL-17和TNF-α均可以作為關(guān)節(jié)損傷進(jìn)展的檢測指標(biāo)，且IL-17和TNF-α呈協(xié)同作用，兩者在RA發(fā)病的短期內(nèi)作為檢測指標(biāo)效果更加理想。研究同時顯示，在關(guān)節(jié)炎早期階段，用中和性抗IL-17抗體治療后，可以顯著減輕關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，X線顯示關(guān)節(jié)損傷被明顯抑制；組化分析也證實在使用抗IL-17抗體治療后，關(guān)節(jié)炎癥得到抑制，阻止了關(guān)節(jié)軟骨和骨的進(jìn)一步破壞。即使在關(guān)節(jié)炎的晚期階段，抗IL-17抗體仍然可以顯著減緩病程的發(fā)展。因此，IL-17的中和治療可以作為RA治療方案的輔助性治療方法之一。有人采用抗IL-17的抗體或疫苗進(jìn)行阻斷治療，也達(dá)到緩解關(guān)節(jié)炎癥狀、減少關(guān)節(jié)損傷的療效。IL-17已經(jīng)成為RA發(fā)病機制中非常重要的一個因素。但是目前基于IL-17的類風(fēng)關(guān)機理和治療研究國內(nèi)外少見報道。 參考文獻(xiàn)： [1]陳光星，劉良，劉清平，陳紀(jì)藩等，青藤堿對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)大鼠滑膜細(xì)胞增殖及凋亡影響的研究 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2005；9（5） [2]張義浜,劉志敏,熊凌霜.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制及其治療方法研究進(jìn)展.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志.2005,21(zl) [3]和雅.青蒿琥酯對實驗性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用及其機制研究.中山大學(xué)碩士學(xué)位論文.2008 [4]蔣江紅.青蒿琥酯的藥理研究纂要.中醫(yī)藥學(xué)刊.2003,21(9) [5]張長城,潘蕾,崔向軍.青蒿琥酯對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞增殖及TNF-α和IL-1β分泌的影響.廣東醫(yī)學(xué)2009,30(7):1048-1049 [6]崔向軍,王燕燕,侯小強,潘蕾,付軍霞.青蒿琥酯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床觀察.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,27(5):645-646 [7]唐碧霞,唐福林.IL-17與自身免疫性疾病關(guān)系的研究進(jìn)展.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床.2008,28(1) [8]劉繼中,紀(jì)宗玲,陳蘇民.OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)與骨破壞性疾病.生物工程學(xué)報,2003,19(6) [9]Kirkham BW Lassere MN Edmonds JP.Synovial membrane cytokine expression is predictive of joint damage progression in rheumatoid arthritis:a two-year prospective study(the damage study cohort).Arthritis and Rheumatism.2006 2.研究意義與目的 本研究以膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠為模型，觀察青蒿琥酯調(diào)控細(xì)胞免疫功能，抑制關(guān)節(jié)破壞的作用，通過檢測T細(xì)胞活化分子CD3、CD71水平,IL-2基因表達(dá)，IL-17蛋白和基因表達(dá)，RANKL/OPG蛋白和基因表達(dá)，系統(tǒng)分析CIA關(guān)節(jié)炎癥和骨質(zhì)破壞情況，闡明青蒿琥酯通過抑制T細(xì)胞活化及其細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕關(guān)節(jié)炎癥和關(guān)節(jié)破壞的分子免疫作用機理，本課題將為揭示青蒿琥酯治療RA的內(nèi)涵提供科學(xué)的實驗依據(jù)，對拓展青蒿琥酯治療RA等自身免疫性疾病的臨床應(yīng)用具有重要的意義。 2． 研究內(nèi)容及工作方案 1．研究目標(biāo)： 證實青蒿琥酯具有抑制關(guān)節(jié)炎癥和骨質(zhì)破壞的作用；闡明青蒿琥酯通過抑制T細(xì)胞活化，減少IL-17的產(chǎn)生，從而治療RA等自身免疫性疾病的分子免疫機制； 2．研究內(nèi)容 2.1 ART對RA的療效，通過關(guān)節(jié)、切片等，檢測CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度，進(jìn)行HE病理切片觀察，照關(guān)節(jié)X光片，對關(guān)節(jié)破壞度做初步研究，并對比三組大鼠（MTX、ART、生理鹽水）關(guān)節(jié)變化情況。 2.2 ART對RA的治療機理，通過檢測T淋巴細(xì)胞的活化度，IL-17的蛋白含量、表達(dá)，IL-17mRNA的表達(dá)以及RANKL/OPG蛋白表達(dá)，并用統(tǒng)計學(xué)方法，進(jìn)行相關(guān)度的研究。 3、工作方案 3.1材料：牛Ⅱ型膠原和弗氏不完全佐劑（美國Chondrex公司）。甲氨蝶呤（MTX），中國上海信宜藥廠。青蒿琥酯（ART），廣西桂林制藥廠。無特定病原體（SPF）純種Wistar大鼠，雄性，體重（100±20）g，飼養(yǎng)環(huán)境：廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院清潔級動物房。PCR marker（北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心），RT-PCR通用試劑盒，IL-2mRNA、IL-17mRNA引物（大連寶生物工程有限公司），大鼠IL-17 ELISA試劑盒，標(biāo)記抗體。 3.2 動物分組及造模 Wistar大鼠，隨機分為造模組和正常對照組，造模成功后（以足腫為標(biāo)志）再隨機分為：造模+生理鹽水組10只（造模對照組），造模+MTX組（MTX組）10只，造模+青蒿琥酯組（青蒿琥酯組）10只。造模用牛Ⅱ型膠原溶于0.1 mmoL/L醋酸中，按2 g/L比例與佐劑1:1充分混合乳化，于大鼠尾根部注射（每只0.2 mL/次）。造模成功即給藥，造模對照組和正常對照組按10 mL/（kg?d）以生理鹽水灌胃，MTX劑量為7.6 mg/(kg?w)，青蒿琥酯用少量碳酸氫鈉溶液溶解，然后用適量生理鹽水稀釋，經(jīng)腹腔內(nèi)注射給藥組，本研究給藥濃度為60 mg/（kg?d）。于給藥后第36天斷頭處死動物。 3.3 足腫脹度的測量：容積法測量雙后肢的足腫脹度。計分法評價四肢足腫脹度：0分：正常；1分：僅有1個趾腫；2分：2個或超過2個趾腫或一個踝關(guān)節(jié)腫脹變形；3分：全部爪腫。每只總計分0~12分。 3.4 足趾關(guān)節(jié)HE病理片的評價：取左前肢和右后肢第3足趾關(guān)節(jié)，固定、切片，HE染色，對中性粒、淋巴細(xì)胞核漿細(xì)胞浸潤、滑膜細(xì)胞增生、纖維組織增生進(jìn)行盲法評價。計分方法：①中性粒細(xì)胞浸潤程度（急性炎癥情況）：0：無浸潤；+：1~5個/HP；++：6~10個/HP；+++：11~15個/HP；++++：形成小膿腫。②淋巴細(xì)胞浸潤程度：0：無浸潤；+：少量存在；++：稀疏散在；+++：大量存在；++++：大量細(xì)胞，并形成淋巴濾泡。③漿細(xì)胞浸潤程度：0：無浸潤；+：1~5 個/HP；++：6~10 個/HP；+++：11~15個/HP；++++：>16個/HP。④滑膜細(xì)胞增生程度：0：無浸潤；+：腫脹增生（多）；++：增多相連；+++：增多雙層；++++：3層以上。⑤滑膜纖維組織增生程度：0：無增生；+：增生占1/3 HP；++：增生占1/2 HP；+++：增生占1 HP；++++：增生>1 HP。⑥關(guān)節(jié)軟骨破壞情況：0：無破壞；+：小灶狀破壞<1/3；++：1/2破壞；+++：2/3 破壞；++++：全部破壞。 3.5 四肢關(guān)節(jié)X光片：每只大鼠的足趾和踝關(guān)節(jié)破壞分骨侵蝕（erosion）和關(guān)節(jié)間隙改變（Joint space narrowing,JSN）兩個方面進(jìn)行評價。骨侵蝕評分標(biāo)準(zhǔn)：0：正常；1：可疑或有一個微小局部病灶；2:2個局部病灶或病灶總面積≤50%；3:3個以上的病灶或病灶總表面積＞50%；4：關(guān)節(jié)面完全破壞，或出現(xiàn)骨縮小。關(guān)節(jié)間隙：0：正常；1：可疑或有一個微小局部病灶；2：關(guān)節(jié)出現(xiàn)狹窄；3：關(guān)節(jié)強直或關(guān)節(jié)間隙增寬。骨侵蝕共96塊骨，關(guān)節(jié)間隙共100個。由影像學(xué)醫(yī)生盲法閱片后評分。 3.6 活化T淋巴細(xì)胞檢測：取腸系膜淋巴結(jié)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞活化CD3、CD71水平，用RT-PCR檢測IL-2mRNA表達(dá)水平。 3.7大鼠血清IL-17的檢測：將大鼠斷頭取血，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，檢測IL-17的蛋白含量；用RT-PCR檢測IL-17mRNA的表達(dá)水平；取滑膜、關(guān)節(jié)，用免疫組化檢測IL-17的蛋白表達(dá)水平。 3.8 RANKL/RANK/OPG蛋白和基因表達(dá)檢測：用免疫組化檢測RANKL/OPG蛋白表達(dá)水平，用RT-PCR檢測RANKL/RANK/OPG mRNA表達(dá)水平。 3.9統(tǒng)計學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)全部錄入計算機，采用SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎兩年致殘率高達(dá)50%，患者生命普遍減少5到10年，致死率高，且每年有大量的患者未得到規(guī)范的治療，開發(fā)針對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的有效藥物迫在眉睫。本研究基本思路是以膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠為模型，觀察青蒿琥酯調(diào)控細(xì)胞免疫功能、抑制關(guān)節(jié)破壞的作用，闡明青蒿琥酯減輕關(guān)節(jié)炎癥和關(guān)節(jié)破壞的分子免疫作用機理。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨特之處
- 1 青蒿琥酯(ART)在治療瘧疾方面取得了較好的療效，除了抗瘧作用外，臨床研究表明ART對RA具有治療作用，但其作用機制尚不清楚，目前這方面的研究國內(nèi)外還比較少見。 2 本課題主要從T細(xì)胞活化及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-17入手，研究其抗炎、抗骨質(zhì)破壞的作用機制，目前在國內(nèi)外未見報道。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 本課題將為揭示青蒿琥酯治療RA的內(nèi)涵提供科學(xué)的實驗依據(jù)，對拓展青蒿琥酯治療RA等自身免疫性疾病的臨床應(yīng)用具有重要的意義。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以慢性多關(guān)節(jié)滑膜炎、骨及軟骨破壞為主要特征的全身性自身免疫性疾病，其主要標(biāo)志是滑膜中白細(xì)胞浸潤。這種炎癥過程能夠刺激抗凋亡成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）的增殖，直接導(dǎo)致形成血管翳和關(guān)節(jié)損傷以及關(guān)節(jié)內(nèi)致炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。RA的發(fā)病率在我國約為0.4%，全球為0.5%-1.0%。該病兩年致殘率高達(dá)50%，患者生命普遍減少5到10年，致死率高，且每年有大量的患者未得到規(guī)范的治療[1]，因此，開發(fā)針對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的有效藥物迫在眉睫。
獲獎情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- 無
同類課題研究水平概述
- 無
