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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 高產(chǎn)紫杉醇菌株的誘變選育及其差異表達(dá)基因消減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 本研究分別采用硫酸二乙酯和紫外線與硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理菌株HD1-3孢子，選育到了1株遺傳性狀穩(wěn)定、高產(chǎn)紫杉醇突變株；成功地構(gòu)建了高產(chǎn)紫杉醇菌株UD14-11與菌株HD1-3差異表達(dá)的cDNA消減文庫(kù)，為尋找、分離微生物生物合成紫杉醇相關(guān)基因和利用基因工程或代謝工程手段定向設(shè)計(jì)改造菌株奠定基礎(chǔ)。
- 詳細(xì)介紹：
- 紫杉醇（taxol）是一種復(fù)雜的具有抗癌活性的三環(huán)二萜類化合物。微生物發(fā)酵法是可以無(wú)限生產(chǎn)、大量獲取紫杉醇的很有前景的方法。但目前利用內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇基本處于試驗(yàn)階段，離工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)還有相當(dāng)大的距離，主要限制因素是篩選到的菌株產(chǎn)量太低和缺乏內(nèi)生真菌紫杉醇生物合成的分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究，因此，高產(chǎn)菌株的選育成為當(dāng)前的首要任務(wù)。 本研究分別采用硫酸二乙酯和紫外線與硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理菌株HD1-3孢子；以選育到的高產(chǎn)紫杉醇菌株為tester，菌株HD1-3為driver，應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建選育到的高產(chǎn)紫杉醇菌株與菌株HD1-3差異表達(dá)的cDNA消減文庫(kù)。試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)確定了Nodulisporium sylviforme紫杉醇產(chǎn)生菌HD1-3孢子復(fù)合誘變的適宜條件，成功地構(gòu)建了高產(chǎn)紫杉醇菌株UD14-11與菌株HD1-3差異表達(dá)的cDNA消減文庫(kù)，文庫(kù)滴度為1.2×107 cfu/mL，陽(yáng)性克隆率75.3 %，片段大小主要集中在300 bp－1.0 kb。本試驗(yàn)研究為尋找、分離微生物生物合成紫杉醇相關(guān)基因和利用基因工程或代謝工程手段定向設(shè)計(jì)改造菌株奠定基礎(chǔ)。
作品專業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 主要目的是選育高產(chǎn)紫杉醇菌株，并構(gòu)建選育到的高產(chǎn)紫杉醇菌株與出發(fā)菌株HD1-3差異表達(dá)的cDNA消減文庫(kù)。 分別采用硫酸二乙酯和紫外線與硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理菌株HD1-3孢子；以選育到的高產(chǎn)紫杉醇菌株為tester，菌株HD1-3為driver，應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建選育到的高產(chǎn)紫杉醇菌株與菌株HD1-3差異表達(dá)的cDNA消減文庫(kù)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 合成紫杉醇的主要限制因素是篩選到的菌株產(chǎn)量太低和缺乏分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究。本試驗(yàn)為選育高產(chǎn)紫杉醇菌株及其合成提供了獨(dú)有的研究材料。國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)有分離紫杉醇生物合成相關(guān)基因的報(bào)道。微生物合成紫杉醇相關(guān)基因的分離及其功能分析是構(gòu)建高產(chǎn)紫杉醇基因工程菌株的重點(diǎn)。試驗(yàn)為尋找、分離微生物生物合成紫杉醇相關(guān)基因和利用基因工程或代謝工程手段定向設(shè)計(jì)改造菌株奠定基礎(chǔ)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 選育到了遺傳性狀穩(wěn)定、高產(chǎn)紫杉醇的突變株，成功地構(gòu)建了高產(chǎn)紫杉醇菌株UD14-11與菌株HD1-3差異表達(dá)的cDNA消減文庫(kù)，為尋找、分離微生物生物合成紫杉醇差異表達(dá)相關(guān)基因和利用基因工程、代謝工程手段定向設(shè)計(jì)改造菌株奠定基礎(chǔ)。為內(nèi)生真菌與其宿主相互關(guān)系的研究提供新的證據(jù)與思路。本試驗(yàn)為早日實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)紫杉醇的工業(yè)化生產(chǎn)向前邁進(jìn)了一大步。故本研究具有一定的科學(xué)意義和潛在的推廣應(yīng)用前景。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的：選育高產(chǎn)紫杉醇菌株并構(gòu)建選育到的高產(chǎn)紫杉醇菌株與出發(fā)菌株HD1-3差異表達(dá)的cDNA消減文庫(kù)。方法:分別采用硫酸二乙酯和紫外線與硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理菌株；以選育到的高產(chǎn)紫杉醇菌株為tester，菌株HD1-3為driver，應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建選差異表達(dá)的cDNA消減文庫(kù)。結(jié)果：試驗(yàn)確定的紫杉醇產(chǎn)生菌HD1-3孢子復(fù)合誘變的適宜條件為：將106 cfu/mL孢子懸液經(jīng)過(guò)8 %硫酸二乙酯處理15 min后，在電磁攪拌下，用紫外燈照射處理45 s，獲得了1株遺傳性狀穩(wěn)定、高產(chǎn)紫杉醇的突變株——UD14-11，其紫杉醇產(chǎn)量從出發(fā)菌株HD1-3的232.73±4.61 μg/L提高至312.81±7.51 μg/L；構(gòu)建的文庫(kù)滴度為1.2×107 cfu/mL，陽(yáng)性克隆率75.3 %，片段大小主要集中在300 bp－1.0 kb。結(jié)論：選育到了1株遺傳性狀穩(wěn)定、高產(chǎn)紫杉醇突變株；成功地構(gòu)建了高產(chǎn)紫杉醇菌株UD14-11與菌株HD1-3差異表達(dá)的cDNA消減文庫(kù)，為尋找、分離微生物生物合成紫杉醇相關(guān)基因和利用基因工程或代謝工程手段定向設(shè)計(jì)改造菌株奠定基礎(chǔ)。
獲獎(jiǎng)情況
- 無(wú)
鑒定結(jié)果
- 無(wú)
參考文獻(xiàn)
- 1.張惠展. 途徑工程—第三代基因工程. 北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2002. 2.張蓓. 代謝工程. 第一版. 天津：天津大學(xué)出版社，2003. 3.劉文，唐功利. 以生物合成為基礎(chǔ)的代謝工程和組合生物合成. 中國(guó)生物工程雜志 4黃薇, 方孝東, 趙文明, 林棲鳳. 分離差異表達(dá)基因的方法. 生物工程學(xué)報(bào)（Chinese Journal of Biotechnology）, 2002, 18（4）：521-524. 5沈萍，范秀容，李廣武. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（第三版）. 北京：高等教育出版社，1999. 6趙凱，周東坡，平文祥，劉軍，馬璽，金濤. 產(chǎn)紫杉醇菌株原生質(zhì)體誘變育種的研究. 生物工程學(xué)報(bào)（Chinese Journal of Biotechnology），2005，21（5）：848-851.
同類課題研究水平概述
- 微生物發(fā)酵合成的主要限制因素是菌株產(chǎn)量太低和缺乏內(nèi)生真菌紫杉醇生物合成的分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究。本試驗(yàn)為選育高產(chǎn)紫杉醇菌株和及其合成的相關(guān)基因提供了獨(dú)有的研究材料。迄今為止在國(guó)內(nèi)外還尚未發(fā)現(xiàn)有從紫杉醇產(chǎn)生菌中分離到紫杉醇生物合成相關(guān)基因的報(bào)道。本試驗(yàn)成功地構(gòu)建了高產(chǎn)紫杉醇菌株差異表達(dá)的cDNA消減文庫(kù)，為尋找、分離微生物生物合成紫杉醇相關(guān)基因和利用基因工程或代謝工程手段定向設(shè)計(jì)改造菌株奠定基礎(chǔ)。 紫杉醇是近年來(lái)世界范圍內(nèi)抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)。在1856年，Lucas H就從歐洲紅豆杉葉片中提取到粉末狀堿性物質(zhì)，即紫杉?jí)A。1963年美國(guó)化學(xué)家首次從一種生長(zhǎng)在美國(guó)西部大森林中稱謂太平洋杉樹(shù)皮和木材中分離到了紫杉醇的粗提物。紫杉醇粗提物對(duì)離體培養(yǎng)的鼠腫瘤細(xì)胞有很高活性，并開(kāi)始分離這種活性成份。世界上進(jìn)行紫杉醇全合成研究的小組有30多個(gè)，美國(guó)佛羅里達(dá)州立大學(xué)的化學(xué)教授毫頓等在此方面一直處于領(lǐng)先地位，于1993年12月9日完成紫杉醇全合成。全合成紫杉醇的成功為研究人員開(kāi)發(fā)生產(chǎn)紫杉醇提供了又一條可行的途徑。 用生物技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇的研究：利用植物細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)紫杉醇，是各種研究方向中十分有吸引力的一個(gè)方向，利用生物技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇，具有不破壞自然環(huán)境、不受自然條件限制的優(yōu)點(diǎn)，是解決紫杉醇來(lái)源的一條重要途徑。 紫杉醇發(fā)展的趨勢(shì)：目前國(guó)內(nèi)外對(duì)紫杉醇的研究方向很多，但仍沒(méi)有比較成型的可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，主要原因：①?gòu)募t豆杉樹(shù)中提取紫杉醇資源不足，又破壞生態(tài)環(huán)境，無(wú)法持續(xù)生產(chǎn)；②紅豆杉的種繁、栽培與扦插盡管可以解決優(yōu)選、優(yōu)育、高產(chǎn)的問(wèn)題，但該種樹(shù)生長(zhǎng)非常緩慢，遠(yuǎn)水不解近渴，難負(fù)重望；③化學(xué)合成與半合成則因紫杉醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子量相對(duì)較大，很難進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)；④細(xì)胞培養(yǎng)法則因?yàn)榘l(fā)酵周期長(zhǎng)且新的高產(chǎn)細(xì)胞株選育耗時(shí)長(zhǎng)，中試投產(chǎn)有一定的困難，解決工業(yè)化大生產(chǎn)更需長(zhǎng)時(shí)間研究。筆者認(rèn)為紫杉醇未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)主要有以下兩方面。 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的關(guān)鍵問(wèn)題是紫杉醇產(chǎn)生菌的分離和發(fā)酵液中紫杉醇產(chǎn)量的提高，目前還有許多技術(shù)關(guān)鍵問(wèn)題需要解決。相信在不久的將來(lái)，選取優(yōu)良的紫杉醇產(chǎn)生菌為出發(fā)菌株，通過(guò)誘變育種、細(xì)胞工程或基因工程手段進(jìn)行改造，從而篩選得到高產(chǎn)工程菌株用于工業(yè)化生產(chǎn)，完全可以徹底解決紫杉醇來(lái)源的危機(jī)。
