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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 鄂西北產(chǎn)蒼耳子甲醇粗提物抑菌活性及其清除DPPH能力的初步評(píng)價(jià)
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 隨著化學(xué)農(nóng)藥在使用中產(chǎn)生的一系列公害問題被發(fā)現(xiàn),如環(huán)境污染、殺傷天敵、破壞生態(tài)平衡等問題,已引起人們的普遍關(guān)注。利用植物體產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)來開發(fā)“環(huán)境友好型農(nóng)藥”是現(xiàn)代農(nóng)藥開發(fā)的重要途徑。本文采用生長(zhǎng)速率法、孢子萌發(fā)法、DPPH自由基清除法，對(duì)產(chǎn)自鄂西北的野生植物蒼耳子甲醇粗提物體外抑菌活性及抗氧化性進(jìn)行了初步測(cè)定，為下一步植物性殺菌劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
- 詳細(xì)介紹：
- 蒼耳，學(xué)名Xanthium sibiricums屬菊科一年生草本植物，別名蒼子、蒼耳子、野落蘇，產(chǎn)于湖北、江蘇、山東、江西等地，在傳統(tǒng)中醫(yī)臨床中，蒼耳子用于鼻淵頭痛、外感風(fēng)寒、風(fēng)濕痹證等病癥的治療[1]。目前，對(duì)蒼耳子活性物質(zhì)參與有害病原微生物控制及其體外抗氧化性方面的研究鮮見報(bào)道。因此，本文采用菌絲生長(zhǎng)法、孢子萌發(fā)法以及DPPH清除法，測(cè)定蒼耳子甲醇粗體物對(duì)幾種真菌的抑制活性及DPPH清除活性，為下一步植物性殺菌劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 供試植物與微生物 蒼耳子X. sibiricum seeds 采自湖北省襄陽(yáng)市古隆中風(fēng)景區(qū)，采集時(shí)間為5～6月份。采回后蒼耳子置陰涼處晾干，粉碎后過40目篩后密封干燥保存。綠色木霉Trichoderma viride，黃瓜灰霉菌Botrytis cinerea，黑曲霉Aspergillus niger，終極腐霉Pythium ultimum，尖鐮孢菌黃瓜轉(zhuǎn)化型Fusarium oxysporum f. sp cucumber，以上五個(gè)菌株由襄樊學(xué)院鄂西北植物資源研究所提供。 1.2 儀器與試劑 微型植物粉碎機(jī)(天津泰斯特)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮)、紫外－可見分光光度計(jì)(日本島津)、冰箱(青島海爾)、顯微鏡(北京泰克)、高壓滅菌鍋(上海博迅)、光照培養(yǎng)箱(廣東醫(yī)療)、電子分析天平(梅特勒-托利多)、空氣恒溫?fù)u床(太倉(cāng)華利達(dá))、索氏抽提器；丙酮(上海國(guó)藥，分析純)、甲醇(上海國(guó)藥，分析純)、乙醇(上海國(guó)藥，分析純)、DPPH(美國(guó)SIGMA)、葡萄糖(上海國(guó)藥，生化純)、瓊脂粉(上海國(guó)藥，生化純)。 1.3 蒼耳子活性物質(zhì)的粗提 蒼耳子活性物質(zhì)的提取采用連索氏抽提法，將粉碎的樣品50g裝入濾紙筒中，在索氏抽提器中用甲醇提取36 h，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得浸膏，用丙酮定容為1g/mL，4℃密封保存?zhèn)溆谩? 1.4 蒼耳子甲醇粗提物對(duì)病原物菌絲生長(zhǎng)的抑制試驗(yàn) 菌絲生長(zhǎng)的抑制活性用生長(zhǎng)速率法測(cè)定。在無菌條件下，取提前配制的不同濃度粗提物溶液1ml與融化的PDA培養(yǎng)基9ml混合，搖勻，趁熱倒入培養(yǎng)皿中制成平板(使供試藥鐘濃度分別達(dá)到0.004g/ml、0.002g/ml、0.0001g/ml)。同時(shí)，用丙酮設(shè)置對(duì)照組。待平板凝固后接入生長(zhǎng)一致的菌餅(Φ=6.0 mm，菌絲面朝下)，每皿接1個(gè)菌餅，每處理重復(fù)3次。置平板于光照培養(yǎng)箱24℃培養(yǎng)至24h后，用十字交叉法測(cè)定供試真菌菌落生長(zhǎng)直徑，用下列公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)的抑制率。 抑制率(%) =(對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑)÷對(duì)照菌落直徑×100% 菌落直徑(mm) = 測(cè)量菌落直徑平均值－6.0 1.5 蒼耳子甲醇粗提物對(duì)病原物孢子萌發(fā)的抑制試驗(yàn) 用無菌生理鹽水沖洗長(zhǎng)滿孢子的培養(yǎng)基，將孢子沖進(jìn)錐形瓶中，用紗布濾去雜質(zhì)。在4個(gè)裝有17ml液體PDA培養(yǎng)基的錐形瓶中加入1ml孢子懸浮液，再向其中3瓶加入2ml不同濃度蒼耳提取液，使藥液終濃度達(dá)到0.004g/ml、0.002g/ml、0.0001g/ml。另1瓶加2ml對(duì)照液(丙酮)，每個(gè)處理重復(fù)3次，置空氣搖床中振蕩培養(yǎng)。孢子萌發(fā)(以孢子芽管長(zhǎng)度大于孢子短半徑者為萌發(fā))后，用無菌水稀釋到適當(dāng)濃度(以10×10低倍鏡下，每個(gè)視野30～40個(gè)孢子為宜)，加到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在10×10倍顯微鏡下觀測(cè)。重復(fù)以上步驟，對(duì)四種供試菌種分別定時(shí)進(jìn)行觀測(cè)。孢子萌發(fā)抑制率的計(jì)算方法： 孢子抑制率(%)=(對(duì)照萌發(fā)數(shù)-處理萌發(fā)數(shù))÷對(duì)照萌發(fā)數(shù)×100% 1.6 蒼耳子甲醇粗提物清除DPPH自由基能力的測(cè)定 精密稱取8.0 mg 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)于50ml容量瓶中，用95%乙醇溶解；樣品溶解于95%乙醇溶液中。取樣品溶液1ml加入到離心管，再加入3ml的DPPH溶液配成樣品溶液。95%乙醇溶液1ml加入到離心管，再加入DPPH溶液3ml配成未加樣品液的DPPH溶液。取樣品溶液1ml加入到離心管，再加入3ml的95%乙醇配成樣品空白溶液。上述溶液在室溫下離心20min后用紫外-可見分光光度計(jì)在517nm下檢測(cè)。測(cè)定樣品溶液吸光度Ai，未加樣品液的DPPH溶液吸光度Ac,樣品空白溶液吸光度Aj。根據(jù)下列公式計(jì)算清除率及半清除率(即IC50值)： 清除率=[1－(Ai－Aj)÷Ac]×100% IC50=50％×消耗的DPPH質(zhì)量／加入的試樣溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量 2 結(jié)果與分析 2.1 蒼耳子粗提物對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制 蒼耳子甲醇粗提物對(duì)五種病原真菌的菌絲生長(zhǎng)都具有一定抑制作用（見表1），同一菌種粗提物濃度越高，抑菌作用越明顯。隨著稀釋比例的增大，抑菌作用逐漸減小。在設(shè)置的最大質(zhì)量濃度為0.004 g/ml時(shí)，最大抑制率分別是40.63%、39.73%、61.01%、44.55%、66.36%，其中，對(duì)尖鐮孢菌黃瓜?；偷囊种苹钚宰罡?，為66.36%；對(duì)黑曲霉的抑制作用最顯著、效果最均一：即使在設(shè)定的最小質(zhì)量濃度0.001 g/ml時(shí)，抑制率仍然達(dá)到43.67%，而此時(shí)對(duì)另外四種病原真菌的抑制率卻很低，最高不到30%。 表1 蒼耳子甲醇粗提物對(duì)病原真菌菌落的抑菌效果 Table 1 Inhibitory effect to pathogenic fungi colony of methanol extract of X. sibiricum seeds 供試菌種 Tested fungi CK 0.004 g/ml 0.002 g/ml 0.001 g/ml 直徑Diameter (mm) 直徑Diameter (mm) 抑制率Inhibitory rate(%) 直徑Diameter (mm) 抑制率Inhibitory rate(%) 直徑Diameter (mm) 抑制率Inhibitory rate(%) 綠色木霉 T. viride 36.6 21.73 40.63 28.14 23.11 30.11 17.73 黃瓜灰霉菌 B. cinerea 44.9 27.06 39.73 35.61 20.69 38.88 13.41 黑曲霉 A. niger 23.7 9.24 61.01 10.08 57.47 13.35 43.67 終極腐霉 P. ultimum 42.6 23.62 44.55 26.88 36.90 30.98 27.28 尖鐮孢菌黃瓜?；? F. oxysporum f. sp cucumber 20.6 6.93 66.36 12.08 41.36 16.70 18.93 注：菌落直徑為5 次試驗(yàn)的平均值。 Note: All the numbers were averaged from experiments conducted five times. 2.2 蒼耳子粗提物對(duì)病原真菌孢子萌發(fā)的抑制試驗(yàn) 由表2可知，蒼耳子甲醇粗提物對(duì)綠色木霉、黃瓜灰霉菌、黑曲霉、終極腐霉、尖鐮孢菌黃瓜專化型五種真菌孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，在設(shè)置的最高質(zhì)量濃度0.004 g/ml時(shí)，對(duì)上述真菌孢子的抑制率分別達(dá)到55.00%、89.19%、67.74%、94.12%，其抑制活性和抑制趨勢(shì)與表1中的菌絲生長(zhǎng)抑制作用相一致。 表2 蒼耳子甲醇粗提物對(duì)病原真菌孢子萌發(fā)的抑制效果 Table 2 Inhibitory effect to spore germination of methanol extract of X. sibiricum seeds 供試菌種 Tested fungi CK 0.004 g/ml 0.002 g/ml 0.001 g/ml 萌發(fā)孢子(個(gè)) No. spore germinated 萌發(fā)孢子(個(gè))No. spore germinated 抑制率 Inhibitory rate (%) 萌發(fā)孢子(個(gè)) No. spore germinated 抑制率 Inhibitory rate (%) 萌發(fā)孢子(個(gè)) No. spore germinated 抑制率 Inhibitory rate (%) 綠色木霉 T. viride 100 45 55.00 70 30.00 75 25.00 黃瓜灰霉菌 B. cinerea 112 54 51.79 80 28.57 87 22.32 黑曲霉 A. niger 185 20 89.19 35 81.08 50 72.97 終極腐霉 P. ultimum 155 50 67.74 60 61.29 85 45.16 尖鐮孢菌黃瓜?；? F. oxysporum f. sp cucumber 85 5 94.12 30 64.71 85 0 注：孢子萌發(fā)數(shù)目為3 次試驗(yàn)的平均值。 Note: All the numbers were averaged from experiments conducted three times. 2.3 蒼耳粗提物對(duì)DPPH的清除能力 ?DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，其結(jié)構(gòu)含有三個(gè)苯環(huán)、一個(gè)帶孤對(duì)電子的氮原子，醇溶液呈紫紅色，在515 nm處有強(qiáng)吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，?DPPH的孤對(duì)電子被配對(duì)而使溶液顏色變淺(黃色)，最大吸收波長(zhǎng)處的吸收減弱。這種顏色變淺的程度與配對(duì)電予數(shù)是成化學(xué)劑量關(guān)系的，因此可用于評(píng)價(jià)自由基的清除情況，從而評(píng)價(jià)試驗(yàn)樣品的抗氧化能力[2]。不同濃度粗提物清除?DPPH能力見表3。 表3 蒼耳子甲醇粗提物清除DPPH自由基的IC50值 Table 3 The IC50 of methanol extracts of X. sibiricum seeds for eleminating DPPH free radical 濃度 concentration (g/ml) 清除率Eleminating rate (%) 回歸方程 regression equation IC50(g/ml) 0.01 96.26 Y=49.3923X+0.4769 R=0.995 0.000468 0.005 73.14 0.0025 62.23 0.00125 54.41 0.000625 48.12 IC50值即清除50％自由基時(shí)，所需要的蒼耳甲醇粗提物濃度。故IC50值越小，蒼耳粗提物清除自由基的能力越強(qiáng)。由表3可知，蒼耳子不同濃度粗提物對(duì)?DPPH均有清除能力，但其清除能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)，蒼耳甲醇粗提物清除DPPH自由基的IC50為0.000468 g/ml。 3 小結(jié)與討論 利用植物體產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)來開發(fā)“環(huán)境友好型農(nóng)藥”是現(xiàn)代農(nóng)藥開發(fā)的重要途徑。本文采用生長(zhǎng)速率法、孢子萌發(fā)法、DPPH自由基清除法，對(duì)產(chǎn)自鄂西北的野生植物蒼耳子甲醇粗提物體外抑菌活性及抗氧化性進(jìn)行了初步測(cè)定。結(jié)果表明，蒼耳甲醇粗提物對(duì)綠色木霉、黃瓜灰霉菌、黑曲霉、終極腐霉、尖鐮孢菌黃瓜專化型五種病原真菌均有一定的抑制作用，其中無論是抑制菌絲生長(zhǎng)還是孢子萌發(fā)，均對(duì)黑曲霉顯示出了顯著的抑制作用；同時(shí)，蒼耳甲醇粗提物對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，IC50為0.000468 g/ml。 鄂西北產(chǎn)蒼耳子甲醇粗提物是一種混合物，到底由哪些成分組成？究竟是哪一種或幾種物質(zhì)在起抑菌作用？這些都有待繼續(xù)深入研究。同時(shí)，混合物中某些成分可能會(huì)對(duì)某些病菌具有促進(jìn)生長(zhǎng)作用。若對(duì)粗提物進(jìn)一步分離純化，可能會(huì)得到只對(duì)病菌具有抑制作用的化學(xué)物質(zhì)，且抑菌作用會(huì)在很大程度上提高。 參考文獻(xiàn) [1]TAN Dao-peng(譚道鵬),WU Zhi-gui(吳志瑰),ZHU Xiao-lan(褚小蘭),et al. Study progress of chemical components of plants from Xanthium L.(蒼耳屬植物化學(xué)成分研究進(jìn)展)[J]. Lishizheng medicine and materia medica reserch( 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥).2007,18(2):501-502 [2]Sopheak Son, Betty A. Lewis. Free radical scavenging and antioxidant activity of caffeic acid amide and ester analogues：structure-activity relationship[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2002, (50):468-472
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 利用植物體產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)來開發(fā)“環(huán)境友好型農(nóng)藥”是現(xiàn)代農(nóng)藥開發(fā)的重要途徑。本文采用生長(zhǎng)速率法、孢子萌發(fā)法、DPPH自由基清除法，對(duì)產(chǎn)自鄂西北的野生植物蒼耳子甲醇粗提物體外抑菌活性及抗氧化性進(jìn)行了初步測(cè)定，為下一步植物性殺菌劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 蒼耳對(duì)一些植物病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用。而蒼耳雖有抑菌活性,但目前對(duì)蒼耳的研究主要集中在醫(yī)學(xué)方面，包括臨床應(yīng)用研究、醫(yī)藥開發(fā)以及保健品的開發(fā)，但其活性物質(zhì)參與農(nóng)作物病害的控制以及其抗氧化性研究鮮見報(bào)道。因此,本文專門對(duì)鄂西北地區(qū)產(chǎn)蒼耳子活性物質(zhì)參與有害病原微生物控制及其體外抗氧化性方面做了初步的研究。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 對(duì)于蒼耳子甲醇粗提物抑菌活性的研究，有助于進(jìn)一步開發(fā)高效無毒無殘留的新型生物農(nóng)藥。另外，對(duì)于其清除DPPH能力的研究，為制備新型食物抗氧化劑、提高抗病能力的保健品、抗衰老的化妝品等提供理論基礎(chǔ)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 本文采用生長(zhǎng)速率法、孢子萌發(fā)法及DPPH自由基清除法，對(duì)產(chǎn)自鄂西北的野生植物蒼耳子粗提物體外抑菌活性及抗氧化性進(jìn)行了初步測(cè)定。結(jié)果表明，倉(cāng)耳子甲醇粗提物對(duì)綠色木霉、黃瓜灰霉菌、黑曲霉、終極腐霉、尖鐮孢菌黃瓜?；臀宸N病原真菌均有一定的抑制作用，其中無論是抑制菌絲生長(zhǎng)還是孢子萌發(fā)，均對(duì)黑曲霉顯示出了顯著的抑制活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，蒼耳子甲醇粗提物對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，IC50為0.000468 g/ml。
獲獎(jiǎng)情況
- 被《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》雜志接收待發(fā)。
鑒定結(jié)果
- 情況屬實(shí)。
參考文獻(xiàn)
- [1]TAN Dao-peng(譚道鵬),WU Zhi-gui(吳志瑰),ZHU Xiao-lan(褚小蘭),et al. Study progress of chemical components of plants from Xanthium L.(蒼耳屬植物化學(xué)成分研究進(jìn)展)[J]. Lishizheng medicine and materia medica reserch( 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥).2007,18(2):501-502 [2]Sopheak Son, Betty A. Lewis. Free radical scavenging and antioxidant activity of caffeic acid amide and ester analogues：structure-activity relationship[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2002, (50):468-472
同類課題研究水平概述
- 1.蒼耳子的作用 蒼耳果實(shí)名“蒼耳子”，祛風(fēng)濕、通鼻竅。實(shí)驗(yàn)證明蒼耳子有降血糖的作用；蒼耳子煎汁對(duì)溶血性金黃葡萄球菌、肺炎雙球菌有明顯抑制作用[1]。蒼耳子O．5g/ml的生藥量，以1：5稀釋可完全抑制皰疹病毒的生長(zhǎng)，以1：10稀釋可抑制100TCID50皰疹病毒的生長(zhǎng)，但對(duì)正常細(xì)胞無毒害作用[2]。這充分說明蒼耳作為藥用具有巨大的潛力與價(jià)值。中國(guó)藥科大學(xué)的戴岳等人對(duì)蒼耳子對(duì)速發(fā)型過敏反應(yīng)的抑制作用作了研究，揭示了一些藥效發(fā)揮的機(jī)理。蒼耳子含有一定的毒蛋白、氫醌、蒼術(shù)苷等毒性成份物質(zhì)，用藥不當(dāng)可導(dǎo)致頭暈、頭痛、食欲不振等神經(jīng)中毒，心肌和肝功能損害癥狀，外敷可致接觸性皮炎。蒼耳子在中藥中中毒量不像西藥那么明確，中毒反應(yīng)輕重不一，因此還需要對(duì)其藥理藥性做更深入的研究，以待將其毒性降至最低，同時(shí)蒼耳子的用藥理論和技術(shù)是值得研究的問題。 2.蒼耳是一種重要的藥用植物，但是在醫(yī)學(xué)上的研究?jī)H限于驗(yàn)方與傳統(tǒng)用藥,其藥用成分和具體機(jī)理的研究還不夠深入。今后應(yīng)將研究重點(diǎn)放在蒼耳活性成分的鑒定、提取和臨床應(yīng)用方面。另外,利用植物體產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)來開發(fā)“環(huán)境友好型農(nóng)藥”是現(xiàn)代農(nóng)藥開發(fā)的重要途徑。繼續(xù)研究蒼耳中分離提取的抗病蟲和抑制植物生長(zhǎng)活性物質(zhì),繼而根據(jù)仿生學(xué)原理模擬合成“環(huán)境友好型農(nóng)藥”仍然是蒼耳在植物保護(hù)方面研究的重要方面。 3.蒼耳分布廣，適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)，可將其種植在貧瘠、干旱的地區(qū)或鹽堿地，充分利用不能用作糧食及蔬菜生產(chǎn)的土地，達(dá)到土地資源和該野生資源的充分利用。而且蒼耳對(duì)Pb、Ca、Cu、Mn等礦物質(zhì)富集能力較強(qiáng)，因此可作為特殊地段的恢復(fù)性植物來改善生態(tài)環(huán)境，治理重工業(yè)區(qū)的污染[3]；其自身的毒性和抑菌物質(zhì)可用來生產(chǎn)天然殺蟲劑，對(duì)于無公害蔬菜和水果的生產(chǎn)都有重大意義。 參考文獻(xiàn) [1]劉玉紅，郝震峰．蒼耳子化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展．山東醫(yī)藥工業(yè)，2003，22(1)：22～23 [2]姜克元，黎維勇，王嵐．蒼耳子提取液抗病毒作用的研究．時(shí)珍國(guó)藥研究.1997，8(3)：217 [3]李倩，相衛(wèi)國(guó)，郝文芳.蒼耳的研究與應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào).2005.21(9)
