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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 一種骨性材料病理制片方法：半固體脫鈣技術(shù)
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 大類：
- 科技發(fā)明制作A類
- 簡(jiǎn)介：
- 骨性材料（人體自然的骨骼以及人造骨骼）被越來(lái)越多地運(yùn)用到了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，研究和觀察這一材料內(nèi)部的細(xì)胞是十分必要的。其重要性體現(xiàn)在通過(guò)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、狀態(tài)、相互關(guān)系等情況來(lái)研究此種骨性材料的應(yīng)用性能以及種植方法的可行性等等。本發(fā)明針對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)探索出一種新型骨性材料病理制片方法—半固體脫鈣技術(shù)，去除鈣卻又不破壞其原有細(xì)胞的特性、位置及相互關(guān)系。
- 詳細(xì)介紹：
- 本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，即在骨性材料脫鈣的同時(shí)，將其中的細(xì)胞保持在原位并且保持原有形態(tài)（不破壞膠原等有形物質(zhì)支撐）和熒光。運(yùn)用自行研制的脫鈣劑及半固體復(fù)型劑使骨組織形成半固體狀態(tài)，類似于膠質(zhì)，去除鈣卻又不破壞其原有細(xì)胞的位置及相互關(guān)系。 運(yùn)用本發(fā)明可使細(xì)胞在原位生長(zhǎng)，并且保持原有的形態(tài)和熒光，可以清楚地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察和研究。運(yùn)用此法脫鈣后的骨性材料經(jīng)速凍固化，獲得的冰凍切片無(wú)需后固定，可以直接用于熒光顯微鏡觀察，或者進(jìn)行普通組化染色、免疫組化以及電鏡觀察等；甚至將不同層面的圖像整合，相互疊加印證，可實(shí)現(xiàn)三維重建。避免了運(yùn)用脫鈣石蠟包埋法或者不脫鈣塑料包埋法造成的抗原抗體反應(yīng)抑制和熒光的淬滅，同時(shí)避免了不脫鈣冰凍切片方法的各種缺點(diǎn)，節(jié)約了成本，提高了效率。方法簡(jiǎn)單、方便，利用易得的儀器和試劑，實(shí)現(xiàn)半固體脫鈣和切片觀察，實(shí)現(xiàn)某些常規(guī)方法無(wú)法完成的脫鈣和觀察。
作品圖片
作品專業(yè)信息
設(shè)計(jì)、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點(diǎn)、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)
- 骨性材料（人體自然的骨骼以及人造骨骼）被越來(lái)越多地運(yùn)用到了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而作為骨性材料應(yīng)用的基礎(chǔ)和前提，研究和觀察這一材料內(nèi)部的細(xì)胞是十分必要的。其重要性體現(xiàn)在通過(guò)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、狀態(tài)、相互關(guān)系等情況來(lái)研究此種骨性材料的應(yīng)用性能以及種植方法的可行性等等。 除上述原因外，熒光蛋白基因標(biāo)記技術(shù)廣泛運(yùn)用迫切需要一種新的制片方法來(lái)配合。但是目前罕有報(bào)道能在骨性材料內(nèi)部清晰地觀察到熒光細(xì)胞——由于在常規(guī)脫鈣、病理制片（包括制備電鏡標(biāo)本）時(shí)，熒光極易消失；骨磨片雖然可以保留熒光，但解剖結(jié)構(gòu)顯示不清；而硬組織切片不僅需要特殊設(shè)備和技術(shù)，且操作不便、切片較厚，所獲信息有限；尤其當(dāng)細(xì)胞和骨生物支架材料復(fù)合的初期，由于缺乏膠原等有形物質(zhì)支撐，常規(guī)脫鈣會(huì)導(dǎo)致材料崩解，無(wú)法觀察組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，并導(dǎo)致熒光淬滅。由于上述原因，熒光蛋白基因標(biāo)記這一先進(jìn)的方法難以運(yùn)用到骨性材料內(nèi)部細(xì)胞的觀察上。 但是由于目前研究手段的限制，觀察骨性材料內(nèi)部的細(xì)胞成為了公認(rèn)的難題。其困難性體現(xiàn)在：（1）天然骨骼的質(zhì)地堅(jiān)硬且折光性差，即使脫鈣也會(huì)造成組織松散，不易觀察（3）人造骨骼（現(xiàn)在多用β-TCP、組織衍生骨或者珊瑚骨等）雖然含有較遠(yuǎn)成分可以脫鈣，但是細(xì)胞在處理過(guò)程中容易變形或者移位，不利于觀察，不能真實(shí)反映細(xì)胞的生長(zhǎng)情況既相互關(guān)系等。（2）被熒光標(biāo)記的細(xì)胞在處理過(guò)程中容易導(dǎo)致熒光淬滅。
科學(xué)性、先進(jìn)性
- ：（1）在骨性材料脫鈣的同時(shí)，將其中的細(xì)胞保持在原位并且保持原有形態(tài)和熒光。（2）半固體脫鈣結(jié)束后可經(jīng)速凍固化，獲得的冰凍切片后，進(jìn)行熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡的直接觀察和拍照。（3）可進(jìn)行免疫組化染色和拍照，了解細(xì)胞間抗原表達(dá)情況，（4）可進(jìn)行HE染色或其它染色，再獲得清晰細(xì)胞顯微圖像，（5）必要時(shí)還可以進(jìn)行電鏡觀察，了解超微結(jié)構(gòu)變化等。以上圖像可以通過(guò)電腦重疊分析，將連續(xù)的冰凍切片數(shù)據(jù)依次整合，則可以獲得詳細(xì)的三維立體數(shù)據(jù)。（6）所涉及的制劑、制片設(shè)備相對(duì)硬組織切片機(jī)價(jià)格便宜、容易獲得，節(jié)約了制片成本，而顯微結(jié)構(gòu)顯示良好，因此具有良好經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用前景。
獲獎(jiǎng)情況及鑒定結(jié)果
- 1、《一種骨植入材料的脫鈣方法》，已提出專利申請(qǐng)，申請(qǐng)?zhí)枺?01010019515.8 2、Shan Jiang, Qian-li Jiang ,Yang Zhang , Le Li , Pei-ran Zhao,Yan-fei Pan,Wei Chang, Luan-jia Liu, Guo-xian Pei《Why we need semisolid decalcification system in bone tissue engineering? A story begins with honeycomb》，Medical hypotheses，75（2010）225-228【IF 1.416】 3、（15th歐洲血液學(xué)年會(huì)2010會(huì)議文摘）Jiang Qianli, Jiang S, Zhang Y, Li L, Zhao PR, Pan YF, Chang W, Liu LJ , Yu GN, Wang HM《SEMI-SOLID DECALCIFICATION AND RESEARCH SYSTEM: A NOVEL METHOD TO STUDY FLUORESCENCE PROTEIN GENE MODIFIED STEM CELLS IN BONE》
作品所處階段
- 專利申報(bào)階段
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
- 無(wú)
作品可展示的形式
- 照片、圖片、實(shí)物、影響
使用說(shuō)明,技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì),適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說(shuō)明,市場(chǎng)分析,經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測(cè)
- 本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于：（1）在骨性材料脫鈣的同時(shí)，將其中的細(xì)胞保持在原位并且保持原有形態(tài)和熒光。（2）半固體脫鈣結(jié)束后可經(jīng)速凍固化，獲得的冰凍切片后，進(jìn)行熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡的直接觀察和拍照。（3）可進(jìn)行免疫組化染色和拍照，了解細(xì)胞間抗原表達(dá)情況，（4）可進(jìn)行HE染色或其它染色，再獲得清晰細(xì)胞顯微圖像，（5）必要時(shí)還可以進(jìn)行電鏡觀察，了解超微結(jié)構(gòu)變化等。以上圖像可以通過(guò)電腦重疊分析，將連續(xù)的冰凍切片數(shù)據(jù)依次整合，則可以獲得詳細(xì)的三維立體數(shù)據(jù)。（6）所涉及的制劑、制片設(shè)備相對(duì)硬組織切片機(jī)價(jià)格便宜、容易獲得，節(jié)約了制片成本，而顯微結(jié)構(gòu)顯示良好，因此具有良好經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用前景。 由于本發(fā)明正處于專利申請(qǐng)階段，具體制作方法此處就不便具體說(shuō)明。 由于本發(fā)明經(jīng)濟(jì)效益高，較目前的制片方法節(jié)約了大量制片費(fèi)用；材料易得以及過(guò)程簡(jiǎn)單，一般實(shí)驗(yàn)室均可完成制片過(guò)程。根據(jù)目前制片過(guò)程，可運(yùn)用于骨性材料生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)室研究、病理診斷等研究或醫(yī)療方面，
同類課題研究水平概述
- 骨性材料被越來(lái)越多地運(yùn)用到了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而作為骨性材料應(yīng)用的基礎(chǔ)和前提，研究和觀察這類材料內(nèi)部的細(xì)胞的生長(zhǎng)、狀態(tài)、相互關(guān)系等情況，來(lái)研究各種種植方法的可行性，以及此種骨性材料的應(yīng)用性能和前景等。比如在骨組織再生工程中，種子細(xì)胞需預(yù)先負(fù)載入骨生物支架材料后再植入體內(nèi)，因此也必須了解進(jìn)入骨性材料的種子細(xì)胞如何先存活，進(jìn)而增殖分化，即了解此種骨性材料的生物相容性等。 熒光蛋白基因標(biāo)記的應(yīng)用使細(xì)胞的觀察到達(dá)了一個(gè)新的時(shí)代。但是目前罕有報(bào)道能在骨性材料內(nèi)部清晰地觀察到熒光細(xì)胞。 由于研究手段的限制，觀察骨性材料內(nèi)部的細(xì)胞成為了公認(rèn)的難題。其困難性體現(xiàn)在：（1）天然骨骼和人造骨骼（現(xiàn)在多用β-磷酸三鈣/β-TCP、組織衍生骨或者珊瑚骨等）的質(zhì)地堅(jiān)硬且折光性差，人造骨骼不含膠原，故常規(guī)脫鈣會(huì)導(dǎo)致組織崩解、細(xì)胞無(wú)處附著；天然骨骼雖然含有膠原成分，但脫鈣也可能造成組織松散、細(xì)胞變形或移位，不利于觀察，不能真實(shí)反映細(xì)胞的生長(zhǎng)情況既相互關(guān)系等；（2）被熒光標(biāo)記的細(xì)胞在處理過(guò)程中容易導(dǎo)致熒光淬滅。 現(xiàn)階段對(duì)于骨性材料的處理有三種主要途徑：一是脫鈣石蠟包埋；二是不脫鈣塑料包埋；三是不脫鈣冰凍切片。其中，由于骨性材料的特殊性——由堅(jiān)硬的骨小梁和柔軟的髓質(zhì)（細(xì)胞團(tuán)等）組成，為了能切割出完整的半薄切片，方便觀察，又以一致地軟性（脫鈣石蠟包埋）或一致的硬性（不脫鈣塑料包埋）為主。但長(zhǎng)期以來(lái)，文獻(xiàn)上對(duì)這兩類技術(shù)頗有爭(zhēng)議。常規(guī)石蠟包埋難免存在一些熱損傷；而一般的塑料包埋半薄切片也會(huì)明顯抑制抗原抗體反應(yīng)，使之無(wú)法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的觀察和研究。鑒于以上情況，某些實(shí)驗(yàn)室就樂(lè)于在冰凍切片上進(jìn)行常規(guī)染色和免疫標(biāo)記染色的觀察，但是不脫鈣的骨組織冰凍切片很罕見，需要特制儀器，費(fèi)用十分高昂，僅見日本有個(gè)別報(bào)道。 蒲權(quán)教授的塑料包埋技術(shù)是經(jīng)改良的，其制備的塑料切片可以進(jìn)行各種免疫組化（抗原抗體）反應(yīng)，但也存在一些問(wèn)題：（1）只適用于小組織（直徑2-3mm以下），如用于更大組織則需要特殊的硬組織切片機(jī)（這種儀器在國(guó)內(nèi)只有少數(shù)單位有用，且費(fèi)用較高）；（2）塑料包埋劑在常規(guī)條件下無(wú)法充分進(jìn)入材料內(nèi)部，因而材料內(nèi)部形成氣泡，切片時(shí)會(huì)導(dǎo)致材料和材料上的細(xì)胞崩解丟失；（3）無(wú)法觀察熒光細(xì)胞，其所用的固定劑可使GFP或RFP等的熒光消失。
