基本信息
- 項目名稱：
- 蝴蝶蘭miR172的克隆與功能驗證
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 很多miRNA在植物的成花過程中，對很多重要轉錄因子的轉錄后或者翻譯水平起調控作用，使植物開花時間的控制更加精細和復雜。其中最引人注意的是miR172，它的靶基因是AP2，在擬南芥中過量表達miR172會造成植物開花顯著提前，而過量表達其靶基因AP2會造成開花延遲。目前對植物miR172的研究僅在擬南芥、水稻等模式生物或者重要農作物中研究得比較深入，在園林觀賞植物中卻未見報道。
- 詳細介紹：
- 蝴蝶蘭是蘭科植物中最重要的一個屬，也是在分子生物學領域研究比較多的一種蘭科植物。研究參與蝴蝶蘭成花調控的miRNA對植物miRNA調控機理是一種補充。蝴蝶蘭是一種重要的經濟花卉，具有很好的經濟效益。但是蝴蝶蘭開花前營養(yǎng)生長時間很長，一般為2年，且其成花要求的條件很嚴格，無法實現周年開花。目前主要催花的方法是通過春化作用，低溫誘導開花。但是低溫催花的耗電量大，增加了培養(yǎng)成本，而且能源的過量消耗不符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求。同時，低溫催花需要很好的密閉環(huán)境，容易滋生灰霉菌等真菌病害，降低了經濟效益。 由此可見蝴蝶蘭成花途徑相關的miR172研究和進一步應用有助于低成本的實現蝴蝶蘭提前開花，具有很強的實踐意義。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 1 對蝴蝶蘭全基因組進行特異性擴增，獲得兩個miRNA172片段； 2 對上述新miRNA172測序，與已知的miRNA172做進化分析和二級結構預測； 3 設計原位雜交探針和半定量RT-PCR檢測上述兩個轉錄本和靶基因TOE1在蝴蝶蘭組織中的表達情況； 4 將新miRNA172轉基因到擬南芥中，統(tǒng)計T3代開花時間并觀察表型。
科學性、先進性及獨特之處
- miRNA是近幾年的轉錄調控的研究熱點之一，其作用機理的研究無論在疾病治療還是遺傳育種中都會具有十分廣闊的應用前景和科學意義。本研究首次以觀賞植物為材料，對開花調控miR172的作用機理進行研究，具有一定的創(chuàng)新性。因為蝴蝶蘭相對擬南芥來說，分子生物學操作更加復雜，小分子RNA的研究更是首次。本研究的另一個目的是能夠創(chuàng)建蝴蝶蘭小分子miRNA的操作平臺，為研究其它蝴蝶蘭miRNA提供基礎。
應用價值和現實意義
- 蘭科植物包含很多重要的經濟花卉，但因其開花周期長，人工催花的成本高，使市場價格提高。目前有基因工程方法轉化開花調控基因，但因調控途徑非常復雜，單個基因的表達變化，往往引起正、負調控共同作用，收效甚微，且可能對營養(yǎng)生長造成不良影響。本研究將轉錄因子上游起調控作用的microRNA進行轉基因和育種，有望在不對其它表型產生明顯改變的情況下促進開花。穩(wěn)定遺傳的轉基因花卉也不存在安全問題，利于推廣應用。
學術論文摘要
- miR172屬于microRNA，在植物花發(fā)育中被證明扮演重要角色，通過抑制靶基因——AP2轉錄因子家族的mRNA下調其蛋白質的表達，從而解除其于正常花器官形成中的壓力?；诒緦嶒炇乙延械暮mcDNA樣本，通過比對已知其它物種中的同源miR172序列設計引物，獲得兩種不同長度的蝴蝶蘭miRNA172-like轉錄本，分別為100bp和250bp，并通過在蝴蝶蘭組織中進行原位表達、半定量PCR、測序分析和轉基因模式生物對該miR172進行了功能驗證。新發(fā)現的PhmiR172具有促進提前開花的功能，與已知的miR172基因具有極高的相似性，可以用于早花蝴蝶蘭株系的培育，并為進一步理解蘭科植物的成花機制提供理論基礎。
獲獎情況
- 1 專利申請一項： 專利申請?zhí)枺?0111006055.8 專利名稱：蝴蝶蘭miR172的克隆與功能驗證 專利發(fā)明人：嚴欽驊，明鳳，韓穎穎。 2 第一作者撰寫SCI論文一篇：蝴蝶蘭miR172的克隆與功能驗證，已完成初稿。
鑒定結果
- 專利申請?zhí)枺?0111006055.8，狀態(tài)：正在審查中。
參考文獻
- 1 Cell, 2004, 116: 281–297. 2 The Plant Cell, 2007, 19: 2736–2748. 3 The Plant Cell, 2003, 15: 2730–2741. 4 BMC Plant Biology, 2009, 9:149. 5 Journal of Experimental Botany, 2011, 62 (2):487-495. 6 The Plant Journal, 2007, 51: 840-849. 7 Developmental Biology, 2006, 295: 324 –326. 8 PNAS, 2005, 102(26): 9412-9417. 9 Plant.Mol. Biol, 2006, 61:781–793 10 Mol.Biol.Evol., 2006, 23(1):107–120.
同類課題研究水平概述
- miRNA作為非編碼序列廣泛存在于各物種的基因組中，但近十年才為人所關注。成熟的miRNA是一類長度很短的單鏈小分子RNA，約20-24 nt，由一段具有發(fā)夾環(huán)結構的、長度為70-80 nt 的單鏈RNA 前體(pre-miRNA)剪切后生成；與Argonaute (Ago)蛋白結合形成RISC（RNA- induced silencing complex），通過與靶mRNA的互補識別，介導RISC將其降解，從而下調靶基因的表達。功能上，它們參與轉錄水平的表達調控，在多種模式生物的發(fā)育過程，例如細胞分化、分裂、生長、衰老、凋亡等調控途徑中表現出至關重要的地位。 目前人們對microRNA的了解并不深入，研究手段也有限。作為新發(fā)現的轉錄后水平調控因子，miRNA被證明在各類生物基因組中潛在的大量未知microRNA在遺傳調控擔當了十分重要的角色，且在同類生物中往往具有很高的同源性，盡管如此，關于miRNA的探索依然具有十分廣闊的研究空間和應用價值。因此目前的研究致力于一邊不斷尋找新的miRNA基因，并對已知miRNA通過克隆和分子探針實驗來確定其在組織調控中的作用；一邊不斷探索miRNA作用的分子作用機制和靶基因。生物信息學的發(fā)展使得我們能夠快速從基因組序列中搜索并推測新的miRNA以及其靶基因序列，但用這種方法存在一定的棄真或納偽風險，依然需要大量的分子克隆驗證新基因的功能。 本研究對象miR172在植物中具有高度的保守性。已知它在擬南芥、水稻、煙草、玉米等五種中的同源基因，通過與靶基因AP2轉錄因子家族的mRNA互補結合將其識別，介導RISC將其降解。由于AP2家族基因的成員眾多，miR172也占據了與營養(yǎng)-生殖發(fā)育轉變相關的調控網絡的相當中心的地位。在花器官內輪，miR172抑制AP2的過高表達，防止其誘導內輪花器官轉變?yōu)榛ū徊o限增殖；在玉米中，miR172在頂端分生組織中下調glossy15(AP2-like)促進營養(yǎng)生長結束進入開花準備階段；此外，miR172還獨立于CO參與了GI介導的光周期開花調控途徑。目前在單子葉蘭科植物中未見對miR172的研究，新發(fā)現的蝴蝶蘭miR172基因無疑對進一步揭示蘭科植物成花機理充實了基礎，更重要的是，miR172在促進植物開花同時對營養(yǎng)生長的影響較小，最具投入生產、培育轉基因早花株系的價值。
