基本信息
- 項目名稱：
- 一種用于在水體病毒污染監(jiān)控中檢測病毒富集效果的重組噬菌體的構建
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 科技發(fā)明制作B類
- 簡介：
- 本研究選擇phiX174噬菌體作為代表，通過在野生型基因組中插入一段特異標簽序列成功構建了一種指示病毒，通過測量富集前后該病毒的含量來評估富集體系效率。相比過去的評估方法，我們發(fā)明的方法在準確性以及實用性等方面有許多優(yōu)勢，為評估病毒富集體系提供了一種新的選擇，為此我們已經設計出相應的試劑盒并著手聯(lián)系污水處理廠等進行實地試驗。此外，本研究提出了一種相對簡便人工構建phiX174噬菌體的新技術。
- 詳細介紹：
- 1、作品思路： 病毒是一種寄生致病的微小病原體，不能獨立生存和繁殖，所以飲用水中的病毒數(shù)量往往很低，檢測病毒首先要進行病毒富集。確定富集體系的效率是準確計算原水中病毒含量的前提。而評估病毒富集效果并不容易，盡管現(xiàn)在很多富集方法都在盡量減少核酸的損失，但是缺少一種精確的評估體系來判斷一種富集方法造成的核酸損失率的大小。過去檢測病毒富集體系效率一般是用吸光光度法。具體來說，將加入和富集的樣品用生物分光光度法定OD值，參照薩姆布魯克等(2002)公式，計算OD260／OD280值與RNA濃度(以腸道病毒為例，RNA濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×400lag／m1)。但是，這種方法有人為因素和儀器誤差的缺陷；第二，具有該吸收波長的物質不僅僅是實驗對象，還包括其他物質；第三，該方法沒有特異性，不能將待測對象與環(huán)境中存在的病毒區(qū)分開來。而本研究構建的重組噬菌體，能夠與環(huán)境中本身存在的噬菌體很好的區(qū)分開來，避免了以上誤差。同樣，如果采用野生型噬菌體或人類病毒等作為指示，常易與環(huán)境中已有的病毒混淆，同時存在安全隱患。本課題研制的重組噬菌體可以成為水體病毒富集檢測的指示噬菌體和標準品，用于水質日常監(jiān)測的實踐。 水體中常見的污染病毒種類很多，最主要的病原有腸道病毒、腺病毒、杯狀病毒等，這些基本都是二十面體結構的病毒，直徑在50～100nm。為此我們選擇了與這些病毒物理構造相對較為近似的噬菌體phiX174。phiX174是否完全適用，尚需要更多的數(shù)據進一步證明，但是從現(xiàn)有的噬菌體角度來看，phiX174是最合適的選擇，我們以后將會考慮選擇其他的病毒。phiX174噬菌體是自然界最小的病毒之一，能夠比較準確地反映富集體系的效率。其核酸部分為單鏈環(huán)狀DNA，含5386個核苷酸，編碼8個基因（圖1）。它也是第一個被測序的DNA基因組。我們將在野生型的phiX174基因組中插入一段較短的DNA序列，那樣我們就可以通過PCR或免疫印記等方便的方法將它們從水中其他病毒中區(qū)別出來，計算富集后的回收率從而評估富集效率。在本研究中，通過基因操作在噬菌體phiX174的基因組上添加一段特征序列，獲得指示噬菌體。我們采用的特征序列是實驗室常用的Flag和His標簽，片段較短對噬菌體而言負擔較小且檢測相對準確方便。富集前定量加入該指示噬菌體，通過過濾、絮凝、吸附等方法進行水體病毒富集后，用特征引物結合Real-time PCR檢測該指示噬菌體的回收率，就可以評判富集體系的效率。若一種富集體系的回收率達到70%以上，則認為該富集方法很有效。除了用于富集效率的評估，也可以用于評估飲用水制備過程中對病毒的清除效果。例如，可以在原水中定量加入該噬菌體，通過紫外、臭氧、加氯、過濾等方法進行病毒的清除，然后用Real-time PCR檢測殘留的病毒量，進行病毒清除效果的檢測。這些方法簡單高效，成本也非常低廉（只需構建一份母本，其余在需要時可通過感染宿主菌進行擴增），有很大的應用價值和現(xiàn)實意義。 所以，使用這種人工噬菌體，我們就可以更準確地檢測富集系統(tǒng)或者消毒系統(tǒng)的效率，從而得到更加準確的數(shù)據反映水中病毒的含量。另外，我們提出的新穎且簡便的人工構建噬菌體技術還可以被用于其他領域。 2、作品創(chuàng)新點 目前，在病毒富集體系的研究中，尚缺少一種評估體系對各種富集方法進行評估，本研究通過構建一種帶有標記的指示噬菌體，來評判一種富集體系在富集過程中造成的核酸損失率的大小。在本研究中，我們通過基因操作在噬菌體phiX174的基因組上添加一段特征序列，獲得指示噬菌體。在富集前定量加入該指示噬菌體，通過過濾、絮凝、吸附等方法進行水體病毒富集后，用特征引物結合Real-time PCR檢測該指示噬菌體的回收率，就可以評判富集體系的效率。若一種富集體系的回收率達到70%以上，則認為該富集方法很有效，以此來建立評估體系。相比過去的評估方法（如測量比較富集前后的OD值等），我們的方法在準確性以及實用性等方面有許多優(yōu)勢，為評估病毒富集體系提供了一種新的選擇。 本研究提出了一種相對簡便人工構建噬菌體的新技術。由于以往研究受到病毒本身的限制：第一，由于病毒的基因組較小，且受到病毒衣殼的限制，不能插入很大的基因如綠色熒光蛋白基因這樣的表達后易于觀察的基因；第二，病毒的基因組不同于質粒，由于存在著大量的重疊序列，在插入基因的同時要保證不影響病毒結構蛋白的轉錄，還要保證插入周圍有酶切位點。我們的方法在構建噬菌體的方法上是一個創(chuàng)新，今后還可以用于其它目的的噬菌體構建。 3、項目可行性論述 本研究中，我們選擇的噬菌體是與水中常見的污染病毒如腸道病毒的構造相對較為近似的噬菌體phiX174。phiX174是二十面體結構的病毒，直徑在50～100nm。phiX174是否完全適用，尚需要更多的數(shù)據進一步證明，但是從現(xiàn)有的噬菌體角度來看，phiX174是最合適的選擇，我們以后將會考慮選擇其他的病毒。phiX174噬菌體是自然界最小的病毒之一，其核酸部分為單鏈環(huán)狀DNA，含5386個核苷酸，編碼8個基因（圖1）。它也是第一個被測序的DNA基因組。我們將在野生型的phiX174基因組中插入一段較短的DNA序列，那樣我們就可以通過PCR或免疫印記等方便的方法將它們從水中其他病毒中區(qū)別出來。 本研究中我們選用的標簽片段是實驗室常用的Flag和His標簽，插入到phiX174的編碼病毒刺突蛋白的H基因中。通過實驗驗證，帶有Flag標簽的噬菌體構建成功，其表達的Flag標簽片段可位于蛋白質的C端或N端。Flag標簽系統(tǒng)已廣泛應用于各種細胞類型，包括細菌、酵母和哺乳動物細胞等，相應的Flag標簽抗體也被廣泛應用。Flag抗體可以用于檢測和Flag標簽融合表達蛋白的表達、細胞內定位，以及純化、定性或定量檢測Flag融合表達蛋白等。同時，實驗室里含有重組得到帶有Flag噬菌體的所有水體將經過處理再排放，故不會在自然界中產生帶有這些特定標簽的噬菌體。 通過檢測，我們已經成功構建了帶有Flag標簽的人工噬菌體。同時，我們已將其用于富集系統(tǒng)的效率檢測。實驗結果表明用這種人工噬菌體檢測富集系統(tǒng)的富集效率是可行的，同時也說明這種人工構建噬菌體的技術也是可行的。
作品圖片
作品專業(yè)信息
設計、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點、技術關鍵和主要技術指標
- 盡管現(xiàn)在很多富集方法都在盡量減少核酸的損失，但是缺少一種定量的評估體系來判斷一種富集方法造成的核酸損失率的大小。以往使用方法測定時有背景干擾且常易與環(huán)境中已有的病毒混淆，同時存在安全隱患。本課題研制的重組噬菌體可以成為水體病毒富集檢測的內部指示噬菌體和標準品，用于水質日常監(jiān)測的實踐。 水源中的主要致病病毒主要是腸道病毒，phiX174噬菌體與腸道病毒相似并且它是自然界中最小的噬菌體，也是第一個被測定全基因組的生物。在本研究中，我們通過基因操作在噬菌體phiX174的基因組上添加一段特征序列，獲得指示噬菌體。在富集前定量加入該指示噬菌體，通過過濾、絮凝、吸附等方法進行水體病毒富集后，用特征引物結合Real-time PCR檢測該指示噬菌體的回收率，就可以評判富集體系的效率。若一種富集體系的回收率達到70%以上，則認為該富集方法很有效。除了用于富集效率的評估，也可以用于評估飲用水制備過程中對病毒的清除效果。例如，可以在原水中定量加入該噬菌體，通過紫外、臭氧、加氯、過濾等方法進行病毒的清除，然后用Real-time PCR檢測殘留的病毒量，進行病毒清除效果的檢測。這些方法簡單高效，有很大的應用價值和現(xiàn)實意義，可以更準確地檢測富集或者消毒系統(tǒng)的富集或消毒效率，從而使檢測水中的病毒含量的數(shù)字更加真實。另外，這種人工構建噬菌體的技術還可能被用于其他領域。
科學性、先進性
- 以往人工噬菌體構建研究受到病毒本身的限制，相關研究較少，集中在還原野生型噬菌體。 本研究首次提出了一種人工構建噬菌體的技術。本研究中，我們選擇的噬菌體是與水中常見的污染病毒如腸道病毒的構造相對較為近似的噬菌體phiX174。其基因組是第一個被測序的DNA基因組。我們將在野生型的phiX174基因組中插入一段較短的DNA序列，那樣我們就可以通過PCR或免疫印記等方便的方法將它們從水中其他病毒中區(qū)別出來。通過實驗驗證，帶有Flag標簽的噬菌體構建成功，其表達的Flag標簽片段可位于蛋白質的C端或N端。 通過PCR檢測，我們已經成功構建了帶有Flag標簽的人工噬菌體。同時，我們已將其用于富集系統(tǒng)的效率檢測。實驗結果表明用這種人工噬菌體檢測富集系統(tǒng)的富集效率是可行的，同時也說明這種人工構建噬菌體的技術也是可行的。
獲獎情況及鑒定結果
- 無
作品所處階段
- 實驗室階段
技術轉讓方式
- 無
作品可展示的形式
- 實物、產品，圖片，樣品
使用說明,技術特點和優(yōu)勢,適應范圍,推廣前景的技術性說明,市場分析,經濟效益預測
- 用指示噬菌體指示富集系統(tǒng)的富集效率方法簡單，在富集前定量加入該指示噬菌體，通過過濾、絮凝、吸附等方法進行水體病毒富集后，用特征引物結合Real-time PCR檢測該指示噬菌體的回收率，就可以評判富集體系的效率。若一種富集體系的回收率達到70%以上，則認為該富集方法很有效。除了用于富集效率的評估，也可以用于評估飲用水制備過程中對病毒的清除效果。這些方法簡單高效，可行性較強。 本項目具有很廣闊的應用前景。據報道，大約有40種病毒傳染病可通過水而傳播。水體污染物的富集在水體整個凈化處理過程中都起到了非常重要的作用，所以構建人工指示噬菌體檢測富集效率能夠更準確的提供水中還有的污染物的含量信息。 盡管有很多富集方法都盡量減少核酸的損失，但缺少一種定量的評估體系來判斷一種富集方法造成的核酸損失率的大小。通過構建帶有標記的噬菌體可以建立水體富集或者消毒的評估體系。該方法簡單高效，有很大的應用價值和現(xiàn)實意義。
同類課題研究水平概述
- 雖然水體病毒污染的危害日益顯現(xiàn)，但目前由于技術條件限制，病毒尚未作為飲用水水質日常監(jiān)測指標。其中，缺乏安全、有效的標準品是重要原因之一。 病毒富集體系效率的檢測，一般是用吸光光度法來測定的，具體來說，將加入和富集的樣品用生物分光光度法定OD值，參照薩姆布魯克等(2002)公式，計算OD260／OD280值與RNA濃度(以腸道病毒為例，RNA濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×400lag／m1)。但是，這種方法有人為因素和儀器誤差的缺陷；第二，具有該吸收波長的物質不僅僅是實驗對象；第三，該方法沒有特異性，不能將待測對象與環(huán)境中存在的病毒區(qū)分開來。而本研究構建的重組噬菌體，能夠與環(huán)境中本身存在的噬菌體很好的區(qū)分開來，避免了以上誤差。同樣，采用野生型噬菌體或人類病毒等作為指示，常易與環(huán)境中已有的病毒混淆，同時存在安全隱患。這一課題構建的重組噬菌體可以成為水體病毒富集檢測的指示噬菌體和標準品，用于水質日常監(jiān)測的實踐。 構建重組phiX174也有一定的技術難度。文獻檢索表明，對于該噬菌體遺傳研究主要限于突變體的分析，尚未有人工構建重組噬菌體的成功報道。本課題研究中通過選擇合適的克隆位點，比較不同的標簽序列等，在構建重組噬菌體方面取得了進展。
