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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 一種用于在水體病毒污染監(jiān)控中檢測病毒富集效果的重組噬菌體的構(gòu)建
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 大類：
- 科技發(fā)明制作B類
- 簡介：
- 本研究選擇phiX174噬菌體作為代表，通過在野生型基因組中插入一段特異標(biāo)簽序列成功構(gòu)建了一種指示病毒，通過測量富集前后該病毒的含量來評估富集體系效率。相比過去的評估方法，我們發(fā)明的方法在準(zhǔn)確性以及實(shí)用性等方面有許多優(yōu)勢，為評估病毒富集體系提供了一種新的選擇，為此我們已經(jīng)設(shè)計(jì)出相應(yīng)的試劑盒并著手聯(lián)系污水處理廠等進(jìn)行實(shí)地試驗(yàn)。此外，本研究提出了一種相對簡便人工構(gòu)建phiX174噬菌體的新技術(shù)。
- 詳細(xì)介紹：
- 1、作品思路： 病毒是一種寄生致病的微小病原體，不能獨(dú)立生存和繁殖，所以飲用水中的病毒數(shù)量往往很低，檢測病毒首先要進(jìn)行病毒富集。確定富集體系的效率是準(zhǔn)確計(jì)算原水中病毒含量的前提。而評估病毒富集效果并不容易，盡管現(xiàn)在很多富集方法都在盡量減少核酸的損失，但是缺少一種精確的評估體系來判斷一種富集方法造成的核酸損失率的大小。過去檢測病毒富集體系效率一般是用吸光光度法。具體來說，將加入和富集的樣品用生物分光光度法定OD值，參照薩姆布魯克等(2002)公式，計(jì)算OD260／OD280值與RNA濃度(以腸道病毒為例，RNA濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×400lag／m1)。但是，這種方法有人為因素和儀器誤差的缺陷；第二，具有該吸收波長的物質(zhì)不僅僅是實(shí)驗(yàn)對象，還包括其他物質(zhì)；第三，該方法沒有特異性，不能將待測對象與環(huán)境中存在的病毒區(qū)分開來。而本研究構(gòu)建的重組噬菌體，能夠與環(huán)境中本身存在的噬菌體很好的區(qū)分開來，避免了以上誤差。同樣，如果采用野生型噬菌體或人類病毒等作為指示，常易與環(huán)境中已有的病毒混淆，同時(shí)存在安全隱患。本課題研制的重組噬菌體可以成為水體病毒富集檢測的指示噬菌體和標(biāo)準(zhǔn)品，用于水質(zhì)日常監(jiān)測的實(shí)踐。 水體中常見的污染病毒種類很多，最主要的病原有腸道病毒、腺病毒、杯狀病毒等，這些基本都是二十面體結(jié)構(gòu)的病毒，直徑在50～100nm。為此我們選擇了與這些病毒物理構(gòu)造相對較為近似的噬菌體phiX174。phiX174是否完全適用，尚需要更多的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明，但是從現(xiàn)有的噬菌體角度來看，phiX174是最合適的選擇，我們以后將會考慮選擇其他的病毒。phiX174噬菌體是自然界最小的病毒之一，能夠比較準(zhǔn)確地反映富集體系的效率。其核酸部分為單鏈環(huán)狀DNA，含5386個(gè)核苷酸，編碼8個(gè)基因（圖1）。它也是第一個(gè)被測序的DNA基因組。我們將在野生型的phiX174基因組中插入一段較短的DNA序列，那樣我們就可以通過PCR或免疫印記等方便的方法將它們從水中其他病毒中區(qū)別出來，計(jì)算富集后的回收率從而評估富集效率。在本研究中，通過基因操作在噬菌體phiX174的基因組上添加一段特征序列，獲得指示噬菌體。我們采用的特征序列是實(shí)驗(yàn)室常用的Flag和His標(biāo)簽，片段較短對噬菌體而言負(fù)擔(dān)較小且檢測相對準(zhǔn)確方便。富集前定量加入該指示噬菌體，通過過濾、絮凝、吸附等方法進(jìn)行水體病毒富集后，用特征引物結(jié)合Real-time PCR檢測該指示噬菌體的回收率，就可以評判富集體系的效率。若一種富集體系的回收率達(dá)到70%以上，則認(rèn)為該富集方法很有效。除了用于富集效率的評估，也可以用于評估飲用水制備過程中對病毒的清除效果。例如，可以在原水中定量加入該噬菌體，通過紫外、臭氧、加氯、過濾等方法進(jìn)行病毒的清除，然后用Real-time PCR檢測殘留的病毒量，進(jìn)行病毒清除效果的檢測。這些方法簡單高效，成本也非常低廉（只需構(gòu)建一份母本，其余在需要時(shí)可通過感染宿主菌進(jìn)行擴(kuò)增），有很大的應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。 所以，使用這種人工噬菌體，我們就可以更準(zhǔn)確地檢測富集系統(tǒng)或者消毒系統(tǒng)的效率，從而得到更加準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)反映水中病毒的含量。另外，我們提出的新穎且簡便的人工構(gòu)建噬菌體技術(shù)還可以被用于其他領(lǐng)域。 2、作品創(chuàng)新點(diǎn) 目前，在病毒富集體系的研究中，尚缺少一種評估體系對各種富集方法進(jìn)行評估，本研究通過構(gòu)建一種帶有標(biāo)記的指示噬菌體，來評判一種富集體系在富集過程中造成的核酸損失率的大小。在本研究中，我們通過基因操作在噬菌體phiX174的基因組上添加一段特征序列，獲得指示噬菌體。在富集前定量加入該指示噬菌體，通過過濾、絮凝、吸附等方法進(jìn)行水體病毒富集后，用特征引物結(jié)合Real-time PCR檢測該指示噬菌體的回收率，就可以評判富集體系的效率。若一種富集體系的回收率達(dá)到70%以上，則認(rèn)為該富集方法很有效，以此來建立評估體系。相比過去的評估方法（如測量比較富集前后的OD值等），我們的方法在準(zhǔn)確性以及實(shí)用性等方面有許多優(yōu)勢，為評估病毒富集體系提供了一種新的選擇。 本研究提出了一種相對簡便人工構(gòu)建噬菌體的新技術(shù)。由于以往研究受到病毒本身的限制：第一，由于病毒的基因組較小，且受到病毒衣殼的限制，不能插入很大的基因如綠色熒光蛋白基因這樣的表達(dá)后易于觀察的基因；第二，病毒的基因組不同于質(zhì)粒，由于存在著大量的重疊序列，在插入基因的同時(shí)要保證不影響病毒結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)錄，還要保證插入周圍有酶切位點(diǎn)。我們的方法在構(gòu)建噬菌體的方法上是一個(gè)創(chuàng)新，今后還可以用于其它目的的噬菌體構(gòu)建。 3、項(xiàng)目可行性論述 本研究中，我們選擇的噬菌體是與水中常見的污染病毒如腸道病毒的構(gòu)造相對較為近似的噬菌體phiX174。phiX174是二十面體結(jié)構(gòu)的病毒，直徑在50～100nm。phiX174是否完全適用，尚需要更多的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明，但是從現(xiàn)有的噬菌體角度來看，phiX174是最合適的選擇，我們以后將會考慮選擇其他的病毒。phiX174噬菌體是自然界最小的病毒之一，其核酸部分為單鏈環(huán)狀DNA，含5386個(gè)核苷酸，編碼8個(gè)基因（圖1）。它也是第一個(gè)被測序的DNA基因組。我們將在野生型的phiX174基因組中插入一段較短的DNA序列，那樣我們就可以通過PCR或免疫印記等方便的方法將它們從水中其他病毒中區(qū)別出來。 本研究中我們選用的標(biāo)簽片段是實(shí)驗(yàn)室常用的Flag和His標(biāo)簽，插入到phiX174的編碼病毒刺突蛋白的H基因中。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，帶有Flag標(biāo)簽的噬菌體構(gòu)建成功，其表達(dá)的Flag標(biāo)簽片段可位于蛋白質(zhì)的C端或N端。Flag標(biāo)簽系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞類型，包括細(xì)菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞等，相應(yīng)的Flag標(biāo)簽抗體也被廣泛應(yīng)用。Flag抗體可以用于檢測和Flag標(biāo)簽融合表達(dá)蛋白的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)定位，以及純化、定性或定量檢測Flag融合表達(dá)蛋白等。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室里含有重組得到帶有Flag噬菌體的所有水體將經(jīng)過處理再排放，故不會在自然界中產(chǎn)生帶有這些特定標(biāo)簽的噬菌體。 通過檢測，我們已經(jīng)成功構(gòu)建了帶有Flag標(biāo)簽的人工噬菌體。同時(shí)，我們已將其用于富集系統(tǒng)的效率檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用這種人工噬菌體檢測富集系統(tǒng)的富集效率是可行的，同時(shí)也說明這種人工構(gòu)建噬菌體的技術(shù)也是可行的。
作品圖片
作品專業(yè)信息
設(shè)計(jì)、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點(diǎn)、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)
- 盡管現(xiàn)在很多富集方法都在盡量減少核酸的損失，但是缺少一種定量的評估體系來判斷一種富集方法造成的核酸損失率的大小。以往使用方法測定時(shí)有背景干擾且常易與環(huán)境中已有的病毒混淆，同時(shí)存在安全隱患。本課題研制的重組噬菌體可以成為水體病毒富集檢測的內(nèi)部指示噬菌體和標(biāo)準(zhǔn)品，用于水質(zhì)日常監(jiān)測的實(shí)踐。 水源中的主要致病病毒主要是腸道病毒，phiX174噬菌體與腸道病毒相似并且它是自然界中最小的噬菌體，也是第一個(gè)被測定全基因組的生物。在本研究中，我們通過基因操作在噬菌體phiX174的基因組上添加一段特征序列，獲得指示噬菌體。在富集前定量加入該指示噬菌體，通過過濾、絮凝、吸附等方法進(jìn)行水體病毒富集后，用特征引物結(jié)合Real-time PCR檢測該指示噬菌體的回收率，就可以評判富集體系的效率。若一種富集體系的回收率達(dá)到70%以上，則認(rèn)為該富集方法很有效。除了用于富集效率的評估，也可以用于評估飲用水制備過程中對病毒的清除效果。例如，可以在原水中定量加入該噬菌體，通過紫外、臭氧、加氯、過濾等方法進(jìn)行病毒的清除，然后用Real-time PCR檢測殘留的病毒量，進(jìn)行病毒清除效果的檢測。這些方法簡單高效，有很大的應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義，可以更準(zhǔn)確地檢測富集或者消毒系統(tǒng)的富集或消毒效率，從而使檢測水中的病毒含量的數(shù)字更加真實(shí)。另外，這種人工構(gòu)建噬菌體的技術(shù)還可能被用于其他領(lǐng)域。
科學(xué)性、先進(jìn)性
- 以往人工噬菌體構(gòu)建研究受到病毒本身的限制，相關(guān)研究較少，集中在還原野生型噬菌體。 本研究首次提出了一種人工構(gòu)建噬菌體的技術(shù)。本研究中，我們選擇的噬菌體是與水中常見的污染病毒如腸道病毒的構(gòu)造相對較為近似的噬菌體phiX174。其基因組是第一個(gè)被測序的DNA基因組。我們將在野生型的phiX174基因組中插入一段較短的DNA序列，那樣我們就可以通過PCR或免疫印記等方便的方法將它們從水中其他病毒中區(qū)別出來。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，帶有Flag標(biāo)簽的噬菌體構(gòu)建成功，其表達(dá)的Flag標(biāo)簽片段可位于蛋白質(zhì)的C端或N端。 通過PCR檢測，我們已經(jīng)成功構(gòu)建了帶有Flag標(biāo)簽的人工噬菌體。同時(shí)，我們已將其用于富集系統(tǒng)的效率檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用這種人工噬菌體檢測富集系統(tǒng)的富集效率是可行的，同時(shí)也說明這種人工構(gòu)建噬菌體的技術(shù)也是可行的。
獲獎(jiǎng)情況及鑒定結(jié)果
- 無
作品所處階段
- 實(shí)驗(yàn)室階段
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
- 無
作品可展示的形式
- 實(shí)物、產(chǎn)品，圖片，樣品
使用說明,技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢,適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說明,市場分析,經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測
- 用指示噬菌體指示富集系統(tǒng)的富集效率方法簡單，在富集前定量加入該指示噬菌體，通過過濾、絮凝、吸附等方法進(jìn)行水體病毒富集后，用特征引物結(jié)合Real-time PCR檢測該指示噬菌體的回收率，就可以評判富集體系的效率。若一種富集體系的回收率達(dá)到70%以上，則認(rèn)為該富集方法很有效。除了用于富集效率的評估，也可以用于評估飲用水制備過程中對病毒的清除效果。這些方法簡單高效，可行性較強(qiáng)。 本項(xiàng)目具有很廣闊的應(yīng)用前景。據(jù)報(bào)道，大約有40種病毒傳染病可通過水而傳播。水體污染物的富集在水體整個(gè)凈化處理過程中都起到了非常重要的作用，所以構(gòu)建人工指示噬菌體檢測富集效率能夠更準(zhǔn)確的提供水中還有的污染物的含量信息。 盡管有很多富集方法都盡量減少核酸的損失，但缺少一種定量的評估體系來判斷一種富集方法造成的核酸損失率的大小。通過構(gòu)建帶有標(biāo)記的噬菌體可以建立水體富集或者消毒的評估體系。該方法簡單高效，有很大的應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。
同類課題研究水平概述
- 雖然水體病毒污染的危害日益顯現(xiàn)，但目前由于技術(shù)條件限制，病毒尚未作為飲用水水質(zhì)日常監(jiān)測指標(biāo)。其中，缺乏安全、有效的標(biāo)準(zhǔn)品是重要原因之一。 病毒富集體系效率的檢測，一般是用吸光光度法來測定的，具體來說，將加入和富集的樣品用生物分光光度法定OD值，參照薩姆布魯克等(2002)公式，計(jì)算OD260／OD280值與RNA濃度(以腸道病毒為例，RNA濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×400lag／m1)。但是，這種方法有人為因素和儀器誤差的缺陷；第二，具有該吸收波長的物質(zhì)不僅僅是實(shí)驗(yàn)對象；第三，該方法沒有特異性，不能將待測對象與環(huán)境中存在的病毒區(qū)分開來。而本研究構(gòu)建的重組噬菌體，能夠與環(huán)境中本身存在的噬菌體很好的區(qū)分開來，避免了以上誤差。同樣，采用野生型噬菌體或人類病毒等作為指示，常易與環(huán)境中已有的病毒混淆，同時(shí)存在安全隱患。這一課題構(gòu)建的重組噬菌體可以成為水體病毒富集檢測的指示噬菌體和標(biāo)準(zhǔn)品，用于水質(zhì)日常監(jiān)測的實(shí)踐。 構(gòu)建重組phiX174也有一定的技術(shù)難度。文獻(xiàn)檢索表明，對于該噬菌體遺傳研究主要限于突變體的分析，尚未有人工構(gòu)建重組噬菌體的成功報(bào)道。本課題研究中通過選擇合適的克隆位點(diǎn)，比較不同的標(biāo)簽序列等，在構(gòu)建重組噬菌體方面取得了進(jìn)展。
