基本信息
- 項目名稱：
- 重金屬銅檢測生物傳感器的構建及其初步應用
- 小類：
- 能源化工
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 重金屬銅的檢測是評價環(huán)境污染的重要指標之一，本項目通過基因敲除技術和基因融合技術成功構建一株能特異、敏感檢測銅離子的微生物傳感器，為監(jiān)測影響到人類健康﹑食品安全的重金屬銅離子提供了一種簡便、高效、高性價比的實施方案。
- 詳細介紹：
- 研究背景： 銅是機體必須的微量元素，但是過量的重金屬銅對于所有的生命體都是有毒的。人體內(nèi)過量的銅參與了很多疾病的發(fā)生和發(fā)展，比如印度兒童肝硬化， Tyrolean嬰兒慢性間質性肝炎、Wilson病等。隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，很多含有銅離子的污染物排放入江河湖泊中，污染了土壤、水源甚至是日常食用的糧食蔬菜，給人類的生活和健康造成了嚴重的危害，因此，對環(huán)境中銅離子的檢測是環(huán)境評估中必不可少的。目前常用的銅離子檢測方法有化學分析法、極譜法、電感耦合法和原子吸收法，這些方法均因操作繁瑣、需要專用的儀器及實驗室配備等存在一定局限性，而生物檢測技術則很好地克服了以上不足。 現(xiàn)有的關于銅離子生物檢測技術的研究主要基于大腸埃希菌體內(nèi)具有針對銅離子的精細調控系統(tǒng)： CopA是一類P-型ATPase，作用是將細胞質內(nèi)的銅離子向核周質泵出；CueO是一類氧化酶，作用是在核周質內(nèi)將Cu+氧化為Cu2+，防止核周質內(nèi)銅離子進入細胞質，cus系統(tǒng)負責將核周質內(nèi)的Cu2+向細胞外環(huán)境泵出，這些作用受到CueR調節(jié)子的調節(jié)。國內(nèi)外研究人員嘗試利用CopA啟動子融合報告基因，以野生型大腸埃希菌作為宿主菌構建生物傳感器來檢測銅離子，其特異性不錯，但是敏感性不高，更為重要的是細菌長期處于高銅環(huán)境會由于自身的保護機制而產(chǎn)生銅離子耐受現(xiàn)象，造成檢測結果的不穩(wěn)定，不能用于污染物的檢測。本研究利用基因敲除技術對宿主菌進行改造，構建了能夠檢測銅離子的特異、敏感型微生物傳感器，有望應用于環(huán)境中銅離子的檢測。 研究內(nèi)容： 基于生物檢測法檢測銅敏感性不高是由于銅離子不能順暢進入大腸埃希菌導致的假設，我們對大腸埃希菌進行改造，并從以下四個方面進行研究： 1）敲除大腸埃希菌體內(nèi)負責將銅離子從細胞內(nèi)向細胞外泵出的基因以及影響銅離子進入細胞內(nèi)的基因； 2）利用光量更強的GFPmut2作為報告基因構建融合報告載體檢測銅離子； 3）對構建好的生物傳感器進行檢測條件的優(yōu)化以及相關參數(shù)的測定； 4）推廣應用于水源、土壤、蔬菜和食品等銅離子的測定。 研究結果: 通過基因敲除技術敲除大腸埃希菌體內(nèi)負責將銅離子從細胞內(nèi)向細胞外泵出的基因copA和cusA以及影響銅離子進入細胞內(nèi)的基因cueO，實驗結果顯示△copA-△cueO-△cusA突變菌對銅離子非常敏感，在M9基礎培養(yǎng)基中生長其敏感性是野生型大腸桿菌MC4100的64倍。以其為宿主菌，同時以光亮更強的GFPmut2作為報告標志基因構建融合報告載體，構建得到的傳感器對銅離子敏感性最高，線性范圍最好，其敏感性為野生型的35倍左右，不僅極易攝取外環(huán)境中的銅離子，使外環(huán)境中銅離子的痕量變化被突變菌株所監(jiān)測到，且保持對銅離子高敏感狀態(tài)的穩(wěn)定性和持久性。 該傳感器線性檢測范圍為5.0×10-5-2.5×10-3 mM（0.0032-0.16 mg/L），國家規(guī)定Cu2+檢測的標準方法——原子吸收光譜法測定水樣的檢測范圍是0.05-5 mg/L，相比之下該生物傳感器最低檢出限更低，敏感性更高，更適于痕量Cu2+的檢測。 研究成果： 1）專利保存菌種一株，保存號為CGMCC No.4624，命名E. coli WMC-006 2）以學生為第一申請人申請專利，已獲得專利受理書。 3）已獲得學校推薦，參與2011年浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃（新苗人才計劃）的申報。 4）榮獲浙江省第二屆大學生生命科學競賽一等獎。 創(chuàng)新之處： 1）本研究通過基因敲除技術敲除大腸埃希菌體內(nèi)維持Cu2+穩(wěn)態(tài)的3個基因，構建對Cu2+高度敏感的三基因突變菌作為宿主菌，解決了普通微生物作為生物傳感器宿主菌檢測敏感性不高的問題。 2）該生物傳感器以增強型綠色熒光蛋白作為報告基因，產(chǎn)生的熒光強弱可以通過肉眼觀察判斷，無需紫外激發(fā)，為野外實時監(jiān)測帶來方便。 3）本方法為監(jiān)測影響到人類健康、食品安全的重金屬銅提供了一種簡便、高效、高性價比的解決方案。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：構建特異、敏感的銅離子檢測生物傳感器。 基本思路：選用綠色熒光蛋白GFPmut2為報告標志物，利用E. coli copA啟動子來構建融合報告載體；采用Red重組系統(tǒng)敲除野生型E. coli MC4100菌體內(nèi)負責維持銅離子穩(wěn)態(tài)的三個基因，構建對銅離子高度敏感的突變菌株作為宿主菌；然后進行條件的優(yōu)化及特異性、敏感性、最適檢測范圍等相關參數(shù)的測定；最后利用該傳感器檢測水樣中的銅離子。
科學性、先進性及獨特之處
- 本作品選用增強型綠色熒光蛋白作為報告標志物，利用E. coli copA啟動子來構建融合報告載體，同時利用基因敲除技術對宿主菌進行改造，解決了普通微生物作為宿主菌檢測銅離子敏感性不高的問題，更是避免了野生型大腸桿菌的銅離子耐受現(xiàn)象而造成檢測結果的不穩(wěn)定，構建了能夠檢測銅離子的特異、敏感型微生物傳感器，為檢測銅離子提供了一種簡便、高效、高性價比的解決方案。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 本研究利用GFPmut2作為報告標志物，不但具有通用性強、易于實現(xiàn)融合表達、熒光穩(wěn)定、檢測方便、無毒害等優(yōu)點，而且具有比普通綠色熒光蛋白更強的熒光信號，日光中的藍光就可以激發(fā)出亮綠色的熒光，為野外實時監(jiān)測帶來很大方便。同時以細菌作為宿主菌，檢測快速﹑成本低且易于維護，并且該生物傳感器對于銅離子的檢測具有很高的敏感度及特異性，有望應用于銅離子檢測的初篩。
學術論文摘要
- 重金屬銅的檢測是評價環(huán)境污染的重要指標之一。為構建能特異、敏感檢測環(huán)境中銅離子的生物傳感器，我們選用綠色熒光蛋白GFPmut2作為報告標志物，利用E. coli copA基因啟動子來構建融合報告載體PcopA::gfpmut2-pET28a；采用Red重組系統(tǒng)敲除野生型E. coli MC4100菌體內(nèi)負責維持銅離子穩(wěn)定狀態(tài)的copA﹑cueO和cusA三個基因，構建對銅離子高度敏感的ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO三基因突變菌株作為宿主菌；然后對此生物傳感器進行測定條件的優(yōu)化及特異性、敏感性、最適檢測范圍等相關參數(shù)的測定；最后利用該傳感器檢測水樣中的銅離子。研究結果表明，此生物傳感器對銅離子具有敏感性高、特異性強和檢出限低等優(yōu)點，對銅離子的敏感性為野生型菌株的35倍左右，且僅被銅離子誘導，而對其它金屬離子不敏感，最適檢測銅離子濃度范圍為5.0×10-5-2.5×10-3 mM。該項研究成功地構建了特異、敏感檢測銅離子的生物傳感器，并將其初步應用于水樣中銅離子的檢測，為監(jiān)測影響到人類健康﹑食品安全的重金屬銅離子提供了一種簡便、高效、高性價比的實施方案。
獲獎情況
- 1. 本作品的前期研究內(nèi)容榮獲浙江省第二屆大學生生命科學競賽一等獎。 2. 該作品獲得的能夠檢測重金屬銅的敏感菌株已經(jīng)保存到中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，編號為CGMCC No.4624，命名E. coli WMC-006；為了保護知識產(chǎn)權，論文雖已完成，但尚未在任何會議、雜志、報刊上公開發(fā)表。 3. 該作品的后續(xù)研究已獲得學校推薦，參與2011年浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃（新苗人才計劃）的申報中
鑒定結果
- 該作品通過基因敲除等技術成功構建對重金屬銅高度敏感、特異的生物檢測傳感器，可以應用于銅離子檢測的初篩，同時專利申請已被受理，并獲浙江省第二屆大學生生命科學競賽一等獎，得到了評審專家的肯定和認可。
參考文獻
- 技術： PCR擴增技術、交叉PCR技術、基因敲除技術、基因克隆技術、電轉化技術、SDS-PAGE等。 技術文獻： 1. Muller T, Feichtinger H, Berger H, et al. Endemic Tyrolean infantile cirrhosis: an ecogenetic disorder. Lancet, 1996, 347(9005):877-880 2. Munson GP, Lam DL, Outten FW, et al. Identification of a copper-responsive two-component system on the chromosome of Escherichia coli K-12. J Bacteriol, 2000, 182(20):5864-5871 4. Ivask A, Rolova T, Kahru A. A suite of recombinant luminescent bacterial strains for the quantification of bioavailable heavy metals and toxicity testing. BMC Biotechnol, 2009, 9:41 5. Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(12):6640-6645 6. Abbruzzetti S, Grandi E, Viappiani C, et al. Kinetics of acid-induced spectral changes in the GFPmut2 chromophore. J Am Chem Soc, 2005, 127(2):626-635
同類課題研究水平概述
- 在過去幾年中，銅離子含量測定在環(huán)境分析中扮演著重要的角色。分析檢測方法也幾度易幟，從原有的極譜法到原子吸收分光光度法、光度法，到電感耦合法，但這些方法往往受到實驗條件的限制，不僅需要大型儀器，同時還存在操作繁瑣等弊端。而生物檢測技術則克服了如上不足，生物檢測技術的基本原理即是利用模式生物對特定化學物質的分子反應機理，需要三種必需的元件：針對特定或具有相似性質的化學物質的感應器；由感應器控制的啟動子；受此啟動子控制的報告基因。在設計生物檢測技術時，由于細菌具有在環(huán)境中大量存在﹑生長快速﹑低成本及易維護等優(yōu)點而受到研究人員普遍親睞。在過去的研究中利用生物檢測法來檢測環(huán)境中的特定污染物已經(jīng)引起了極大的關注，至今已經(jīng)研發(fā)了一系列針對特定有機物和無機化合物的生物傳感器，如：重金屬、甲苯及其衍生物以及其它物質。 現(xiàn)在對銅離子測定的生物檢測技術也有所研發(fā)，其中比較清楚大腸桿菌針對銅離子的反應機理，大腸桿菌具有精細的調控系統(tǒng)使得細胞內(nèi)銅離子保持在較低的水平，CopA是一類P-型ATPase，作用是將細胞質內(nèi)的銅離子向核周質泵出；CueO是一類氧化酶，作用是在核周質內(nèi)將Cu+氧化為Cu2+，防止核周質內(nèi)銅離子進入細胞質（銅離子只有一價形式可以穿過細胞膜）；當大腸桿菌處在低濃度的銅離子環(huán)境中，CopA和CueO會被大量的誘導表達，其受到CueR調節(jié)子的調節(jié)。高濃度的銅離子會激活Cus系統(tǒng)，使得銅離子從核周質向外環(huán)境泵出。這個機理提供了一個很好的檢測模式，研究人員嘗試利用copAp::lux和CueRCopA::LuxCDABE融合報告基因以野生型E. coli作為宿主菌來檢測銅離子，這些特異性不錯，但是敏感性不是很高，更重要的是野生型大腸桿菌長期處于高銅的環(huán)境由于自身的保護機制而造成銅離子耐受，其作為檢測銅的宿主菌會造成不穩(wěn)定，這些非常不利于污染物的檢測，必須采用新的方法提高生物學檢測方法檢測銅離子的敏感度。 本項目敲除copA、cueO和cusA基因，構建了一株對銅離子高度敏感的大腸桿菌突變菌株，以其作為宿主菌來檢測銅離子，其靈敏度提高到野生型的35倍。且利用GFPmut2蛋白作為報告物，它比野生型GFP蛋白更亮，而且藍光就可以激發(fā)出亮綠色的熒光，不需要紫外設備愛就能觀測到熒光，因為日光里就含有藍光，這也為野外檢測帶來方便。
