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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 凝膠上安全便捷DNA檢測技術(shù)的開發(fā)
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本研究所提出的甲基紫染色法檢測DNA技術(shù)不需要固定，只需染色和水洗兩個(gè)步驟，可在20分鐘內(nèi)完成，并且具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、染色背景好、使用安全、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明該方法有望代替高致畸致癌性的EB染色法，將在多方面超過國際上公認(rèn)的染料檢測技術(shù)，從而填補(bǔ)了國內(nèi)空白并具有國際先進(jìn)性。
- 詳細(xì)介紹：
- 在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中，作為生物體內(nèi)的重要大分子，核酸是研究生命現(xiàn)象與本質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)，特別是隨著基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的快速發(fā)展，它的應(yīng)用范圍越來越廣，主要包括：對(duì)特定基因功能的識(shí)別、新藥篩選、疾病診斷、藥物作用機(jī)理、生物各個(gè)時(shí)期的發(fā)育變化等方面的研究，它幾乎滲透到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。因此，對(duì)核酸的研究具有重要的意義。同時(shí)，目前凝膠分離是研究DNA的最常用手段使得凝膠上DNA的檢測技術(shù)對(duì)DNA的相關(guān)研究起著至關(guān)重要的作用。本研究開發(fā)的DNA染料檢測技術(shù)有很多指標(biāo)國際領(lǐng)先。該技術(shù)生產(chǎn)工藝相對(duì)簡單，成本相對(duì)低廉，產(chǎn)品的安全性較好，可以在較小的資金投入下實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品化，因此風(fēng)險(xiǎn)較低。產(chǎn)品使用成本可控制在5-10元人民幣/張凝膠不等，給整個(gè)生物大分子檢測行業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)產(chǎn)生較好的社會(huì)效益。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 本研究最終目標(biāo)是開發(fā)安全、便捷、靈敏的DNA檢測試劑盒，從而滿足科研工作者對(duì)靈敏、便捷、安全、高通量檢測技術(shù)的迫切需求。 通過查閱大量文獻(xiàn)，因此設(shè)想用甲基紫代替EB檢測DNA。自從我們5人參與這一研究后，通過大量實(shí)驗(yàn)，不斷攻克如何改善甲基紫檢測DNA技術(shù)這一難題，做了甲基紫染料和不同產(chǎn)品的對(duì)比(如安全性、靈敏度、重現(xiàn)性、操作步驟等等)，同時(shí)總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，取得成效。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 1.靈敏度高：最低檢測量達(dá)到2-4 ng/band；2.操作簡捷：不需要固定，只需染色和水洗兩個(gè)步驟，可在20分鐘內(nèi)完成；3.重現(xiàn)性好：受溫度、搖床擺動(dòng)頻率等外部條件影響?。?.染色背景好；5.使用安全：采用毒性低的試劑，提高實(shí)驗(yàn)操作的安全性，對(duì)環(huán)境污染??；6.成本低：預(yù)實(shí)驗(yàn)表明該方法有望代替高致畸致癌性的EB染色法，將在多方面超過國際上公認(rèn)的染料檢測技術(shù)，從而填補(bǔ)了國內(nèi)空白并具有國際先進(jìn)性。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 由于基因?qū)W的飛速發(fā)展，DNA檢測市場將逐年擴(kuò)大，前景很是樂觀。經(jīng)初步研究表明：本研究開發(fā)的DNA檢測技術(shù)有很多指標(biāo)國際領(lǐng)先，較適合高通量的基因組分析研究，這將打破國外大公司在DNA染色領(lǐng)域?qū)Ω咝录夹g(shù)試劑和試劑盒的壟斷地位，是解決全國生物醫(yī)藥在DNA染色領(lǐng)域問題的關(guān)鍵。該技術(shù)生產(chǎn)工藝相對(duì)簡單，成本相對(duì)低廉，產(chǎn)品的安全性較好，這給整個(gè)生物大分子檢測行業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)產(chǎn)生較好的社會(huì)效益。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 在本研究中，我們開發(fā)了一種新型的以聚丙烯酰胺凝膠[7]為載體的DNA染料染色法，即甲基紫(MV)染色法。經(jīng)過電泳，凝膠在100毫升的染色液中染色需要20分鐘。之后，凝膠在100毫升的50%乙醇中洗滌1分鐘接著泡在100毫升的去離子化水中脫色1分鐘。一般將甲基紫溶解到90%的乙醇中制成0.4%的母液，儲(chǔ)存在嚴(yán)格密封的鋁箔瓶中室溫保存數(shù)月。在使用前，用去離子水稀釋該母液制成0.0008%的甲基紫染色液。 我們最新開發(fā)的MV染色法的靈敏度已接近目前最常用的EB染色法，但它安全、便捷、環(huán)保的特點(diǎn)將有望取代EB染色法。并且，我們所開發(fā)的甲基紫染色液在部分實(shí)驗(yàn)室的試用情況也證明，它滿足了科研工作者對(duì)DNA檢測技術(shù)的要求，是一種具有良好應(yīng)用前景的DNA染色方法。
獲獎(jiǎng)情況
- 1、論文《凝膠上安全便捷DNA檢測技術(shù)的開發(fā)》 已投稿至中國藥科大學(xué)的《藥物生物技術(shù)》 2、專利申請(qǐng)《甲基紫在DNA檢測中的應(yīng)用》 受理號(hào)：201110096266.7 3、所獲獎(jiǎng)勵(lì)：溫州醫(yī)學(xué)院第十二屆“挑戰(zhàn)杯” 大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽二等獎(jiǎng)
鑒定結(jié)果
- 預(yù)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)本染色法、EB染色法、NB染色法的靈敏度的比較，表明本染色法可檢測2-4 ng/band DNA，其靈敏度已經(jīng)接近EB染色法（該法目前常用），實(shí)驗(yàn)得濃度0.0008%（PH6-8）為最佳。
參考文獻(xiàn)
- [1]N.C. Stellwagen, Electrophoresis of DNA in agarose gels, polyacrylamide gels and in free solution, Electrophoresis 30 (2009) S188–S195. [2] Long, X. F., L, D. S.,W, N., Z, C. H. et al., Spectrochimica Acta Part A 2008, 69,142-147. [3] B.J. Bassam, P.M. Gresshoff, Silver staining DNA in polyacrylamide gels, Nat. Protoc. 2 (2007) 2649–2654. [4]Lee-Jun C. Wong. GJB2 mutation spectrum in Inner Mongolia and its comparison with other Asian populations[J]Journal of Otology, 2007, (02) . [5] Y.I. Yang, H.Y. Hong, I.S. Lee, D.G. Bai, G.S. Yoo, J.K. Choi, Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels, Anal. Biochem. 280 (2000) 322–324. [6]Seville M. A whole new way of looking at things: the use of Dark Reader technology to detect fluorophores, 2001,22(5): 814-828. [7]Jin LT, Choi JK. Usefulness of visible dyes for the staining of protein or DNA in electrophoresis. Electrophoresis, 2004, 25(15): 2429-2438.
同類課題研究水平概述
- DNA結(jié)構(gòu)與功能的研究及其定性、定量檢測一直是分析化學(xué)和生命科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域，凝膠上染色作為檢測DNA的常用手段，能夠快速的對(duì)DNA進(jìn)行分析。所以，尋找一種凝膠上安全便捷的染色技術(shù)成為DNA檢測研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。 目前用于凝膠上DNA研究和測定的方法有熒光染色法、有機(jī)染料染色法、銀染法、負(fù)染法，而國內(nèi)外90%以上的實(shí)驗(yàn)室都采用了熒光染色法中的EB法。報(bào)道過用于DNA檢測的熒光染料的文獻(xiàn)，主要包括Hoechst 33258、Pico Green、YOYO、TOTO等。銀染法是迄今為止靈敏度最高的一種染色方法，其染色結(jié)果在可見光下即可直接檢識(shí)。有機(jī)染料染色法的染色結(jié)果同樣可以在可見光下直接檢識(shí)，而且具有操作簡便、重現(xiàn)性好、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。 我國電泳染色試劑約有2億元的市場，隨著生命科學(xué)的飛速發(fā)展，潛力巨大。但是，我國的電泳染色試劑基本有以下缺點(diǎn)：質(zhì)量常不過關(guān)、批次常不穩(wěn)定、大量依賴進(jìn)口。而國內(nèi)染色試劑產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀-存在問題有以下幾點(diǎn)：1、品種——國內(nèi)尚無熒光、負(fù)染試劑盒；2、技術(shù)——染色技術(shù)研發(fā)方面投入不足；3、質(zhì)控——原料多依賴進(jìn)口，其穩(wěn)定性影響試劑質(zhì)量；4、評(píng)價(jià)機(jī)制——試劑生產(chǎn)廠家替代評(píng)價(jià)環(huán)節(jié)薄弱。在1960年至1980年間，國內(nèi)外染色試劑主要以染料染色法為主。到了2000之后，就以熒光染色法為主。1970年至1980年間，國外申請(qǐng)專利只有32項(xiàng)，之后的每十年分別為227項(xiàng)、361項(xiàng)和612項(xiàng)。而在1960年至1970年間，國外發(fā)表SCI論文42項(xiàng)，之后每十年分別為136項(xiàng)、217項(xiàng)、356項(xiàng)和377項(xiàng)。相對(duì)而言，國內(nèi)申請(qǐng)專利有16項(xiàng)，其中本科研小組所在的團(tuán)隊(duì)的占了7項(xiàng)。國內(nèi)發(fā)表SCI論文35篇，而本團(tuán)隊(duì)就有23篇。長時(shí)間的市場調(diào)研，顯示國外主要試劑提供公司有BIO—RAD、SIGMA和Agilent等，國內(nèi)則主要有碧云天、科瑞生物和本團(tuán)隊(duì)的安得森公司。本團(tuán)隊(duì)不管在國內(nèi)還是國外該領(lǐng)域中都具有很好的優(yōu)勢。 本研究開發(fā)具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)且具有快速、靈敏、適合基因組學(xué)研究的DNA檢測技術(shù)，填補(bǔ)了國內(nèi)空白并具有國際先進(jìn)性。該研究成果將打破國外大公司在DNA染色領(lǐng)域?qū)Ω咝录夹g(shù)試劑和試劑盒的壟斷地位，成為解決全國生物醫(yī)藥在DNA染色領(lǐng)域的問題的關(guān)鍵。
