基本信息
- 項目名稱：
- PNRSV單克隆抗體及其ELISA檢測試劑盒的制備
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 科技發(fā)明制作A類
- 簡介：
- 我國對PNRSV的ELISA檢測均依賴于國外的抗血清。價格昂貴，檢測的成本非常高。該作品在制備了針對PNRSV的單克隆抗體的基礎上，開發(fā)了檢測田間植物中是否攜帶PNRSV的ELISA檢測試劑盒。試劑盒開發(fā)的技術含量高，但試劑盒使用時的技術含量低，對儀器設備要求低，適于推廣至鄉(xiāng)鎮(zhèn)級基層檢驗檢疫部門的工作人員操作使用，應用前景廣闊。
- 詳細介紹：
- 應用雜交瘤技術制備了3株分泌針對李屬壞死環(huán)斑病毒（PNRSV）單抗的細胞株，分別命名為1D11、2G7和4H2。三種抗體均只與PNRSV發(fā)生反應，不與近似種李屬矮縮病毒、蘋果莖痘病毒和蘋果褪綠葉斑病毒等的抗原發(fā)生交叉反應，在檢測了單抗效價和檢測靈敏度的基礎上，建立了1D11稀釋10000倍，酶標二抗稀釋5000倍，植物樣品的檢測濃度為50mg/mL的間接ELISA檢測系統(tǒng)用于田間樣品的檢測，并進一步開發(fā)了試劑盒。該試劑盒的樣品檢測量大于400份。在此檢測系統(tǒng)下，能準確檢測待檢植物樣品是否攜帶有PNRSV。
作品專業(yè)信息
設計、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點、技術關鍵和主要技術指標
- 一、目的 制備基于單克隆抗體的能檢測出李屬壞死環(huán)斑病毒（PNRSV）的ELISA檢測試劑盒，幫助各出入境檢驗檢疫局、基層植物保護站、植物檢疫站工作人員解決可以快速、準確地鑒定近幾年新入侵我國的植物病毒PNRSV的難題。 二、基本思路 1. 應用雜交瘤技術，通過動物免疫、細胞融合、細胞克隆化培養(yǎng)及酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測，篩選出能分泌針對PNRSV的單克隆抗體的細胞株； 2. 應用ELISA檢測單克隆抗體的特異性明確該抗體的應用前景； 3. 通過測定單克隆抗體的效價、檢測靈敏度以及樣品的稀釋倍數(shù)對檢測結果的影響，確定ELISA檢測的最佳工藝條件，開發(fā)出基于單克隆抗體并適于PNRSV檢測的ELISA試劑盒。 三、創(chuàng)新點 1．國內首次制備出針對PNRSV的單克隆抗體； 2．國內首次確定采用ELISA檢測田間發(fā)病植株的最佳工藝條件，并開發(fā)出檢測PNRSV的試劑盒。 四、技術關鍵 1．篩選出分泌針對PNRSV的單克隆抗體的雜交瘤細胞株； 2．制備PNRSV的ELISA檢測試劑盒。 五、主要技術指標 利用該試劑盒能準確鑒定出植物樣品中是否含有PNRSV。
科學性、先進性
- 基于單克隆抗體的ELISA解決了多抗血清容易產(chǎn)生交叉反應的問題，它將McAb與抗原的免疫反應以及酶的高效催化反應有機的結合在一起，具有檢測靈敏度高、特異性強、儀器簡單、自動化程度高、檢測田間樣本多等特點。很好的解決了植物病毒很難用傳統(tǒng)的生物學方法和電鏡檢測法進行鑒定的難題。此外，該方法的核心技術是要制備出高度特異性的McAb。這一部分工作的技術含量高，要求有專業(yè)實驗室、先進的儀器設備及經(jīng)驗豐富的專業(yè)科研人員才能完成。一旦制備出了McAb，后期的ELISA檢測則具有操作簡單、設備要求少、易于推廣等特點。基層單位只要有恒溫培養(yǎng)箱、普通冰箱和微量移液槍或微量進樣器等設備就具備該方法的實驗條件。而基層農技術人員則只需要按照ELISA檢測步驟把試劑逐步加入到酶標板的反應條中并按時洗滌更換反應即可。試驗的結果則根據(jù)反應的顏色變化來判定，十分直觀。
獲獎情況及鑒定結果
- 無
作品所處階段
- 實驗室階段
技術轉讓方式
- 技術入股
作品可展示的形式
- 實物、產(chǎn)品
使用說明,技術特點和優(yōu)勢,適應范圍,推廣前景的技術性說明,市場分析,經(jīng)濟效益預測
- 利用基于單克隆抗體的ELISA檢測試劑盒具有檢測特異性高、成本低、時間短、檢測量大、操作方便等優(yōu)點，經(jīng)濟效益十分明顯。 本試劑盒適于各出入境檢驗檢疫局、植物保護站和植物檢疫站的基層工作人員使用，原因如下：（1）只要按照試劑盒說明書即能完成檢測；（2）基層工作單位具備恒溫培養(yǎng)箱、普通冰箱和微量移液槍等簡單的設備，（3）試劑盒提供全部試劑，能保證試劑盒的推廣應用。 分子生物學方法的檢測成本為近10元/樣品，且檢測成本不隨樣品數(shù)增加而降低。應用本試劑盒，前期細胞株的篩選成本約15000元，此后的檢測成本低于0.6元/樣品。由于細胞株篩選的成本是一定的，因此，檢測的數(shù)量越大，每一個樣品分攤的成本越低，只要檢測樣品總量達到3萬個，則每檢測一個樣品的全部成本約為1元。如果全國所有縣、市的植物保護站和植物檢疫機構甚至是國外的相關機構都采用該試劑盒，其樣品檢測的數(shù)量可達幾十萬個/年，經(jīng)濟效益可觀。
同類課題研究水平概述
- 1 國外的研究及發(fā)展 Valleau（1932）首次在李和桃樹上發(fā)現(xiàn)PNRSV造成的危害。目前，該病的發(fā)生已遍及歐洲、亞洲、非洲、南美和北美洲及大洋洲的40多個國家和地區(qū)。普遍危害歐洲大櫻桃、酸櫻桃、桃、蘋果、杏和洋李等李屬和薔薇屬植物，此外還侵染煙草、西瓜、菜豆、豌豆、草木樨、萵苣、向日葵等草木寄主。2002年Verma等又報道了新的寄主秋海棠。 據(jù)國外研究，該病毒侵染危害能力較強，幾乎可侵害所有的李屬植物，引起壞死，皺縮、花葉、環(huán)斑等，特別在苗期中發(fā)生會造成嚴重損失。被侵染的作物損失一般在10%-15%，嚴重時可達70% 。 國外對PNRSV的研究報道較多，除早期的發(fā)生與診斷外，檢測PNRSV的方法主要用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。采用分子生物學技術檢測PNRSV并對病毒基因組序列進行測定也已成形，RT-PCR和IC-RT-PCR已應用于PNRSV的檢測。 2 國內的研究及發(fā)展 PNRSV是我國重點控制的對外檢疫性有害生物，中國學者近年來也開展了對PNRSV的研究。周媛月等在對陜西西安地區(qū)甜櫻桃園的調查中，首次報道了PNRSV在中國境內的發(fā)生情況。山東、遼寧兩省也相繼檢測發(fā)現(xiàn)了PNRSV。李明福等（2005年）對北京懷柔地區(qū)部分核果類果園進行疫情調查時，發(fā)現(xiàn)有PNRSV感染的情況，韓麗娟等（2007年）用分子生物學的方法首次鑒定了PNRSV對百合的侵染，證明了百合是PNRSV的一個新寄主。 PNRSV為核果類果樹的主要病毒，侵染核果類各種果樹，危害嚴重。這一病毒在我國甜櫻桃上感染率很高，且多與ApMV混合感染，造成嚴重的樹體衰弱和流膠。 PNRSV的檢疫方法有：生物學方法、電鏡檢測法、分子生物學方法和免疫學方法。酶聯(lián)免疫吸咐（ELISA）法是病毒檢測的常用技術手段。ELISA檢測技術具有靈敏度高、特異性強、安全、快速、一次可作大量樣品等優(yōu)點，非常適用果樹病毒的普查和快速檢測。目前我國對PNRSV的ELISA檢測均依賴于購買國外的抗血清。檢測效果好，但從國外進口抗血清價格非常昂貴，導致檢測的成本非常高。因此，我國應加強對核果類病毒抗體制備方面的研究。 本實驗通過制備針對PNRSV的單克隆抗體，確定ELISA檢測的最佳工藝條件，并開發(fā)了檢測試劑盒，幫助我國快速準確地鑒定進境花卉攜帶的PNRSV。
