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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 類牛源抗菌肽NK-16多重原核表達(dá)及活性檢測(cè)
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 以牛的抗菌肽（Indolicidin）序列為模板，設(shè)計(jì)出具有抗菌活性新型抗菌肽NK-16。根據(jù)氨基酸序列和E.coli偏愛密碼子，反向翻譯設(shè)計(jì)并合成四段堿基序列。利用Overlapping PCR技術(shù)，獲得三串聯(lián)目的基因并成功克隆入pET 30a(+)載體中。經(jīng)ITPG誘導(dǎo)獲得大量表達(dá)，目的蛋白純化酶切后仍具有抗菌活性。
- 詳細(xì)介紹：
- 本試驗(yàn)在Indolicidin的氨基酸序列基礎(chǔ)上，進(jìn)行了蛋白酶切位點(diǎn)的篩選，重新設(shè)計(jì)新的抗菌肽NK-16人工合成經(jīng)鑒定仍具有抗菌活性。根據(jù)NK-16的氨基酸序列選用大腸桿菌的偏好密碼子，通過反向翻譯設(shè)計(jì)合成了四段NK-16的基因片段，利用Overlapping-PCR技術(shù)，獲得了目的基因片段。雙酶切后成功克隆到表達(dá)載體pET-30a(+)，經(jīng)ITPG誘導(dǎo)得到目的蛋白，純化蛋白蛋酶切后獲得具有抗菌活性的目的多肽。為抗菌肽的原核低成本、高效表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：通過基因工程手段大量獲得抗菌肽 思路：首先篩選出抗菌活性高、抗菌譜廣、分子量較小的抗菌肽，根據(jù)偏好密碼子，人工設(shè)計(jì)所需要的基因片段，然后構(gòu)建表達(dá)載體，最后誘導(dǎo)表達(dá)純化，通過生物學(xué)手段鑒定出表達(dá)抗菌肽的抗菌活和抗譜。從而獲得具有活性的表達(dá)抗菌肽。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 本文根據(jù)NCBI中的報(bào)道序列，人工設(shè)計(jì)合成新的抗菌肽NK-16基因，利用Over-laping PCR技術(shù)，獲得三段NK-16的重復(fù)基因序列。這種方法使抗菌肽通過蛋白酶切位點(diǎn)連接起來(lái)避免了抗菌肽本身對(duì)大腸桿菌的抑制和殺滅作用，同時(shí)可增加多肽的表達(dá)量，從而可降低試驗(yàn)和生產(chǎn)成本。構(gòu)建了NK-16基因的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌獲得了高效的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化酶切后仍具有抗菌活性。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 作品通過基因工程技術(shù)在微生物中直接表達(dá)抗菌肽，由于抗菌肽分子小，而且表達(dá)產(chǎn)物可能對(duì)宿主有害，進(jìn)而影響了基因的高水平表達(dá)。本論文解決了在抗菌肽生產(chǎn)過程中效率低、成本高等亟待解決的問題。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素相比其抗菌性具有很大優(yōu)越性，特別的抗菌肽不產(chǎn)生耐藥性。但抗菌肽的來(lái)源一直是進(jìn)行藥理研究和推廣應(yīng)用難以突破的瓶頸。由于抗菌肽的分子小、含量低，直接從生物組織中提取、分離提純存在一定的困難。而化學(xué)合成成本高不易推廣應(yīng)用。基因工程就成為獲得抗菌肽的主要手段。本文以牛的抗菌肽（Indolicidin）序列為模板，設(shè)計(jì)出具有抗菌活性新型抗菌肽NK-16。根據(jù)氨基酸序列和E.coli偏愛密碼子，反向翻譯設(shè)計(jì)并合成四段堿基序列。利用Overlapping PCR技術(shù)，獲得三串聯(lián)目的基因并成功克隆入pET 30a(+)載體中。經(jīng)ITPG誘導(dǎo)獲得大量表達(dá)，目的蛋白純化酶切后仍具有抗菌活性，為抗菌肽的原核高效表達(dá)和進(jìn)一步生產(chǎn)大量的抗菌肽樣品奠定了基礎(chǔ)。
獲獎(jiǎng)情況
- 付登峰, 胡建和, 劉興友. 抗菌肽基因工程表達(dá)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2010, 37(9): 124-126. Jianhe Hu, Minglu Xu, Bolin Hang, Lan Wang, Qing Wang, Junjie Chen, Tao Song, Dengfeng Fu, Ziliang Wang, Sanhu Wang, Xingyou Liu. Isolation and characterization of an antimicrobial peptide from bovine hemoglobin a-subunit.[J] World J Microbiol Biotechnol, 2011(27): 767–771. 付登峰, 胡建和, 劉興友. 動(dòng)物源性抗菌肽抗菌機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2010(5): 24-26
鑒定結(jié)果
- 情況屬實(shí)
參考文獻(xiàn)
- 進(jìn)行抗菌肽研究的表達(dá)體系包括真核和原核表達(dá)體系兩種，其中在原核表達(dá)體系中大腸桿菌表達(dá)體系用的最多具有代表性，真核表達(dá)體系有小球藻表達(dá)體系、桿狀病毒介導(dǎo)的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)體系，其中酵母表達(dá)體系用的最多可以說是真核表達(dá)體系的代表。 在過去的20年里，人們對(duì)大腸桿菌系統(tǒng)的遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面有了充分的認(rèn)識(shí)，使之成為表達(dá)許多外源蛋白質(zhì)的首選表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌遺傳圖譜明確、易培養(yǎng)、周期短、費(fèi)用低，對(duì)許多蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的耐受能力，能較高水平地表達(dá)多種蛋白質(zhì)。所以大腸桿菌是應(yīng)用于DNA重組技術(shù)的主要宿主細(xì)菌。
同類課題研究水平概述
- 進(jìn)行抗菌肽研究的表達(dá)體系包括真核和原核表達(dá)體系兩種，其中在原核表達(dá)體系中大腸桿菌表達(dá)體系用的最多具有代表性，真核表達(dá)體系有小球藻表達(dá)體系、桿狀病毒介導(dǎo)的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)體系，其中酵母表達(dá)體系用的最多可以說是真核表達(dá)體系的代表。 在過去的20年里，人們對(duì)大腸桿菌系統(tǒng)的遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面有了充分的認(rèn)識(shí)，使之成為表達(dá)許多外源蛋白質(zhì)的首選表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌遺傳圖譜明確、易培養(yǎng)、周期短、費(fèi)用低，對(duì)許多蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的耐受能力，能較高水平地表達(dá)多種蛋白質(zhì)。所以大腸桿菌是應(yīng)用于DNA重組技術(shù)的主要宿主細(xì)菌。李秀蘭等對(duì)天然抗菌肽CMIV的氨基酸序列作了50%的改動(dòng)，根據(jù)E.coli偏愛的密碼子人工合成了肽基因片段，克隆到測(cè)序載體，再將此片段亞克隆至表達(dá)載體pET28上進(jìn)行表達(dá)，融合蛋白經(jīng)溴化氰裂解法（CNBr）裂解后，具有與天然抗菌肽相同的生物活性。2004年浙江大學(xué)的Peng等將人β-防御素2(hBD2)的基因插入到pET-32a(+)中構(gòu)建融合表達(dá)載體，以大腸桿菌BL21為工程菌進(jìn)行表達(dá)，純化后的蛋白具有抗菌活性，該研究表明應(yīng)用基因工程技術(shù)可以大規(guī)模制備抗菌肽。Rao等采用串聯(lián)表達(dá)的方式在大腸桿菌中表達(dá)hPAB-β取得成功，在1～8個(gè)不同重復(fù)序列的串聯(lián)表達(dá)體系中，3個(gè)重復(fù)序列時(shí)蛋白產(chǎn)量最高，達(dá)到菌體總蛋白的27.8%，相當(dāng)于(3.15±0.45)g/L濕菌。為了獲得大量fetidin，趙曉瑜等從蚯蚓(Eisenia fetida)中釣取fetidin的基因，分別克隆到pKW32和pMXB10中，構(gòu)建了融合和非融合表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果無(wú)論是融合還是非融合表達(dá)，產(chǎn)物均以包涵體形式存在。融合表達(dá)產(chǎn)物通過親和層析獲得復(fù)性，復(fù)性產(chǎn)物對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌具有抗菌活性。說明有些抗菌肽在進(jìn)行融合表達(dá)時(shí)，不影響抗菌肽的抗菌活性。為了驗(yàn)證重組抗菌肽Ranalexin的抑菌活性，謝芳等提取牛蛙皮膚組織總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增抗菌肽基因ranalexin，克隆測(cè)序后，將該基因插入pGEX23X融合表達(dá)載體，進(jìn)行原核表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)復(fù)性純化后對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯的體外抑菌活性。綜合以上研究表明，原核表達(dá)是目前運(yùn)用大腸桿菌進(jìn)行的抗菌肽基因工程研究的主要方式。
