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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞引導(dǎo)腦血管發(fā)育的研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 本實(shí)驗(yàn)利用凝膠墨汁標(biāo)記血管，Nestin標(biāo)記放射狀細(xì)胞，GFAP標(biāo)記成熟星型膠質(zhì)細(xì)胞，再用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察腦片。發(fā)現(xiàn)在小鼠腦發(fā)育早期，小血管生長(zhǎng)方向與放射狀膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)突起延伸方向一致；中期及成熟期，大量來源于放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的星型膠質(zhì)細(xì)胞伸出膨大的足板參與血腦屏障的構(gòu)筑，以上表明神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的確在CNS血管發(fā)育中起指導(dǎo)作用，同時(shí)對(duì)理解腦血管瘤的發(fā)生有積極作用。
- 詳細(xì)介紹：
- 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中數(shù)量最多的一類細(xì)胞，最早人們認(rèn)為它們僅僅起支持和營(yíng)養(yǎng)作用，而隨后大量研究表明它們?cè)贑NS的生長(zhǎng)﹑發(fā)育﹑工作和修復(fù)等活動(dòng)中扮演著更加重要的角色。在前人已取得的成果基礎(chǔ)上，我們采用免疫組織化學(xué)和凝膠墨汁灌注的方法，針對(duì)皮質(zhì)區(qū)發(fā)育中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化和血管發(fā)育的關(guān)系進(jìn)行探究，希望找出神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在血管發(fā)育中的地位，為今后進(jìn)一步的工作做鋪墊，同時(shí)，完善腦發(fā)育中血管發(fā)育的理論，并為臨床提供一些有益的指導(dǎo)。 神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)上有諸多相似性，在發(fā)育上也有許多協(xié)同性，一些軸突引導(dǎo)分子，如成形素、生長(zhǎng)因子、血管生成因子等對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)的發(fā)育有雙重作用[37]，所以，二者之一發(fā)生異常都會(huì)導(dǎo)致如Alzheimer’s diease(AD)、amyotrophic lateral sclerosis(ALS) 等神經(jīng)退行性疾病[38]。對(duì)神經(jīng)血管發(fā)育關(guān)系及其機(jī)制的研究有利于我們了解這些疾病的發(fā)病原理，找到對(duì)策，從而給疾病的治療提供指導(dǎo)，具有十分重要的意義。 實(shí)驗(yàn)按照： 凝膠墨汁灌注與取材→免疫組織化學(xué)染色→圖像采集的步驟進(jìn)行 首先選取C57BL/6J成年健康小鼠，常年在相對(duì)濕度60％～70％、室溫在22～25 ℃環(huán)境下飼養(yǎng)。定期消毒，房間面積60 m2。按自然晝夜節(jié)律采光，自由進(jìn)食和飲水。小鼠飲用水選用實(shí)驗(yàn)室自制單蒸水，并定期更換墊料、消毒。實(shí)驗(yàn)中將雌雄鼠于18：00時(shí)以2：1合籠，次日8：00前查栓，發(fā)現(xiàn)母鼠陰道栓塞之日計(jì)為受孕0天（Embryonic，E0）定為妊娠的開始，仔鼠出生當(dāng)日計(jì)為生后當(dāng)天（postnatal day 0，P0）。選取E15、E17、P0、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P10、P12、P14、P16、P18、P20、P25、P30、P60小鼠。 然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色：從切片上剝離瓊脂糖，腦片放在六孔板中并以0.1M PB液漂洗3次×5min，然后轉(zhuǎn)移到24孔板中，每孔加5-6片。 每孔加入100-200μL一抗混合溶液（Nestin: 1: 200; GFAP: 1: 80），置于4℃冰箱中孵育48h。移除一抗，加入PB液，將腦片轉(zhuǎn)移到六孔板中，加PB液漂洗3次×5min，再次轉(zhuǎn)移到新的24孔板，避光條件下加入100-200μL二抗（山羊抗鼠（488）：1: 100；山羊抗兔（568）：1: 100）混合溶液，常溫下于振蕩搖床上孵育8h。 移除二抗，加入PB液，切片轉(zhuǎn)移到六孔板中用0.1M PB液漂洗3次×5min。 用65%甘油和指甲油封片。 陰性對(duì)照，以等量PB液代替一抗混合液，其他步驟不變。 上述步驟完成后進(jìn)行圖像采集（本實(shí)驗(yàn)采用FLUOVIEW FV1000激光共聚焦熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司 ） 正常開機(jī)后，設(shè)置激光共聚焦顯微鏡的step size為1- 2μm，掃描5- 11層，肉眼下用低倍鏡在腦片皮質(zhì)區(qū)上選擇適合的區(qū)域，然后轉(zhuǎn)入高倍鏡自動(dòng)掃描，三個(gè)波段同時(shí)進(jìn)行。所獲得的圖片利用FV10-ASW 1.6 Viewer軟件處理以達(dá)到最理想效果。 通過觀察分析可知:發(fā)育早期，小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)域存在大量Nestin陽性細(xì)胞，胞體位于腦室區(qū)，它們的長(zhǎng)突起由胞體向外延伸，呈放射狀平行排列，在小血管周圍大量分布；相同區(qū)域的GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量較少，主要在大血管周圍分布。隨時(shí)間增長(zhǎng)，Nestin陽性細(xì)胞的數(shù)量越來越少，相反，GFAP陽性細(xì)胞的數(shù)量在增長(zhǎng)。至成熟期（P14），Nestin陽性細(xì)胞只在部分小血管周圍殘留，GFAP陽性細(xì)胞伸出的突起末端膨大形成足板，在血管附近分布，參與血腦屏障的構(gòu)成。 整個(gè)過程中，血管有兩個(gè)特征：第一，小血管延伸方向始終與Nestin陽性細(xì)胞長(zhǎng)突起延伸方向相同，并隨突起方向變化而變化。第二，GFAP陽性細(xì)胞在成熟大血管周圍分布，且數(shù)量隨年齡增加而變多，隨血管變粗足板數(shù)量也增加，分布更加密集。血管的發(fā)育過程與放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的分化過程一致，這些顯示二者間存在某種關(guān)系，總體的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明放射狀膠質(zhì)細(xì)胞引導(dǎo)血管發(fā)育。 根據(jù)形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)提供的直觀結(jié)果我們可以說神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在血管發(fā)育中有引導(dǎo)作用，即神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可提供血管發(fā)育的模板，至于它們發(fā)揮作用的具體方式和分子機(jī)制還難以詳細(xì)說明。但是通過本實(shí)驗(yàn)的研究，有利于我們了解腦血管肌瘤，進(jìn)一步控制腦血管畸形的產(chǎn)生，對(duì)臨床上治療腦血管畸形有很大價(jià)值。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化和腦血管發(fā)育的關(guān)系進(jìn)行研究，找出神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在血管發(fā)育中的作用，同時(shí)完善腦發(fā)育中血管發(fā)育的理論，并對(duì)腦血管畸形的研究有一定的指導(dǎo)作用。 思路：本實(shí)驗(yàn)利用凝膠墨汁標(biāo)記血管，Nestin標(biāo)記放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，GFAP標(biāo)記成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞，再用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察大腦皮質(zhì)中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化與腦血管發(fā)育的關(guān)系
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 本實(shí)驗(yàn)的先進(jìn)性與獨(dú)特性在于利用凝膠墨汁標(biāo)記血管，該方法為形態(tài)學(xué)觀察提供了直觀且有力的證據(jù)，這些證據(jù)是內(nèi)在分子機(jī)制的外在表現(xiàn)。同時(shí)該實(shí)驗(yàn)利用Nestin標(biāo)記放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，GFAP標(biāo)記成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞，再用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察腦片等先進(jìn)技術(shù)也都體現(xiàn)出了作品的科學(xué)性。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 本實(shí)驗(yàn)一方面豐富了血管發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的研究，同時(shí)對(duì)醫(yī)學(xué)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究具有一定的指導(dǎo)作用。研究表明神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在支持、營(yíng)養(yǎng)血管的發(fā)生，參與血腦屏障方面有一定的作用。通過本實(shí)驗(yàn)的研究，我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在引導(dǎo)血管發(fā)育過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的指導(dǎo)作用。進(jìn)而對(duì)理解腦血管瘤的發(fā)生有積極作用，對(duì)腦血管畸形在臨床治療上很有價(jià)值。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中數(shù)量最多的一類細(xì)胞，最早人們認(rèn)為它們僅僅起支持和營(yíng)養(yǎng)作用，而隨后大量研究表明它們?cè)贑NS的生長(zhǎng)﹑發(fā)育﹑工作和修復(fù)等活動(dòng)中扮演著更加重要的角色。前人在視網(wǎng)膜上完成的大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明在血管發(fā)育過程中，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮了關(guān)鍵性的指導(dǎo)作用，在CNS發(fā)育中也可能擁有相同的地位。本實(shí)驗(yàn)利用凝膠墨汁標(biāo)記血管，Nestin標(biāo)記放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，GFAP標(biāo)記成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞，再用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察腦片。發(fā)現(xiàn)在小鼠腦發(fā)育早期，小血管生長(zhǎng)方向與放射狀膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)突起延伸方向一致；中期及成熟期，大量來源于放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞伸出膨大的足板參與血腦屏障的構(gòu)筑，這些表明神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的確在CNS血管發(fā)育中起到指導(dǎo)作用。 目前已知的研究表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在支持、營(yíng)養(yǎng)血管的發(fā)生，參與血腦屏障方面有一定的作用。但是通過本實(shí)驗(yàn)的研究，我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在引導(dǎo)血管發(fā)育過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的指導(dǎo)作用，進(jìn)而對(duì)理解腦血管瘤的發(fā)生有積極作用，對(duì)腦血管畸形在臨床治療上很有價(jià)值。
獲獎(jiǎng)情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- [1] 王亮，梁英銳, 唐外星等. 人胚胎毛細(xì)血管形態(tài)發(fā)育—超微結(jié)構(gòu)及圖像分析儀定量研究.解剖學(xué)報(bào), 1991, 22(4)：430- 433. [2] Abner Louissaint, Jr, Sudha Rao, Caroline Leventhal, Steven A Goldman. Coordinated Interaction of Neurogenesis and Angiogenesis in the Adult Songbird Brain. Cell, 2002, 34: 945- 960. [3] Burnstock G. Ralevic V. New insights into the local regulation of blood flow by perivascular nerves and endothelium. Br. J. Plast. Surg, 1994 , 47：527– 543. [4] Black JE, Polinsky M. Progressive failture of cerebral angiogenesis suporting neura plasticity in ageing rats. Neurobiol Ageing, 1989, 10(4) ：353- 358. [5] Doris D Wang, Angelique Bordey. The astrocyte odyssey. Progress in Neurobiology, 2008, 86, 342 - 367. [6] Evanko DS，Zhang Q，Zorec R。et a1．Defining pathways of loss and secretion of chemical messengers from astrocytes．Glia，2004，47(3)：233—240．
同類課題研究水平概述
- 目前已知的研究表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在支持、營(yíng)養(yǎng)血管的發(fā)生，參與血腦屏障方面有一定的作用。但是通過本實(shí)驗(yàn)的研究，我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在引導(dǎo)血管發(fā)育過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的指導(dǎo)作用，進(jìn)而對(duì)理解腦血管瘤的發(fā)生有積極作用，對(duì)腦血管畸形在臨床治療上很有價(jià)值。 腦血管畸形是腦血管先天性、非腫瘤性發(fā)育異常。是指腦血管發(fā)育障礙而引起的腦局部血管數(shù)量和結(jié)構(gòu)異常，并對(duì)正常腦血流產(chǎn)生影響。其破裂出血主要表現(xiàn)為腦內(nèi)出血或血腫，其多見于年輕人，得到確診年齡平均20－40歲。已知的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)血管的支持，營(yíng)養(yǎng)起到一定的作用，同時(shí)參與腦血屏障。通過本實(shí)驗(yàn)的研究，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)血管的發(fā)生起到關(guān)鍵性的指導(dǎo)作用，進(jìn)一步對(duì)腦血管瘤的發(fā)生產(chǎn)生了積極的作用，有利于我們更好的控制腦血管畸形的發(fā)生以及治療。 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是腦的主要組成成分，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）細(xì)胞總數(shù)的90%。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞沒有尼氏體，表面與神經(jīng)細(xì)胞一樣有許多突起，但沒有樹突和軸突之分。胞間不能形成突觸聯(lián)系，胞膜上有隨胞外K+濃度變化而產(chǎn)生的電位差，卻不會(huì)形成動(dòng)作電位也不能傳遞神經(jīng)沖動(dòng)。 放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（RGC）最早出現(xiàn)在E9/E10期，來源于神經(jīng)上皮細(xì)胞,是腦發(fā)育早期存在的一類細(xì)胞,成熟CNS中少見。RGC呈放射狀，胞體卵圓形，有細(xì)長(zhǎng)無分支的突起，呈apical-basal雙級(jí)突起形態(tài),有明顯的細(xì)胞極性，是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞一種，有部分星形膠質(zhì)細(xì)胞的性質(zhì)。 星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte，AST）是CNS中含量最多，體積最大的一類膠質(zhì)細(xì)胞。在形態(tài)、受體分布、胞質(zhì)活性物含量等方面,不同的AST之間存在明顯的異質(zhì)性。另外，不同腦區(qū)的AST會(huì)通過縫隙連接形成三維的膠質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。 成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞的足板覆蓋著絕大部分大腦血管的表面，是血腦屏障（ blood brain barrier BBB）的三種細(xì)胞組分之一,但是AST在哺乳動(dòng)物的腦內(nèi)不被認(rèn)為具有屏障作用，而是對(duì)誘導(dǎo)和維持BBB起到關(guān)鍵作用。 查閱目前有關(guān)文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)有類似的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化與腦血管發(fā)生方面的發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)資料與報(bào)道，該作品補(bǔ)充了這一領(lǐng)域的空白，有一定的理論與臨床價(jià)值。
