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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 芹菜素對(duì)乳腺癌T47D細(xì)胞系的增殖抑制作用及對(duì)裸鼠皮下移植瘤的影響
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 目前，化療仍是乳腺癌的主要治療手段，但化療會(huì)造成骨髓抑制等副作用而限制了化療藥物的使用，因而近年來(lái)聯(lián)合中醫(yī)藥治療乳腺癌成為研究熱點(diǎn)。芹菜素是一種存在于蔬菜，水果及茶葉等植物中的天然化合物，據(jù)報(bào)道，芹菜素能夠?qū)Χ喾N腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制作用，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，芹菜素在體內(nèi)具有較小的副作用。我們以乳腺癌T47D細(xì)胞株為研究對(duì)象，初步研究了芹菜素在體外和體內(nèi)的增殖抑制作用，并探討其機(jī)制。
- 詳細(xì)介紹：
- 乳腺癌已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國(guó)家及發(fā)展中國(guó)家最為常見(jiàn)女性惡性腫瘤。本研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素能夠誘導(dǎo)G2/M期阻滯，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)和體外能夠有效的抑制乳腺癌T47D細(xì)胞株的增殖，可能與芹菜素抑制PI3K/Akt通路相關(guān)。 本研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素可將乳腺癌T47D細(xì)胞系的細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。細(xì)胞周期由G2期進(jìn)入M期需要CyclinB1/Cdc2復(fù)合物的參與。Western Blotting結(jié)果顯示CyclinA，CyclinB1，Cdc2的明顯減少，此外，p-Chk2，p-Cdc2，p-Cdc25c及p21表達(dá)明顯增高。細(xì)胞在進(jìn)入G2期之前，Cdc2被Wee1及Myt1等磷酸化而處于失活狀態(tài)，同時(shí)也可被Cdc25c去磷酸化而激活。芹菜素能夠?qū)⑿z點(diǎn)激酶Chk2磷酸化而激活，后者使得Cdc25c發(fā)生磷酸化，進(jìn)而與14-3-3結(jié)合成復(fù)合物而失活，磷酸化的Cdc2由于無(wú)法去磷酸化而使細(xì)胞周期無(wú)法通過(guò)G2期進(jìn)入到M期。同時(shí)，CyclinA，CyclinB1表達(dá)的減少也與G2/M的阻滯密切相關(guān)。此外，p21也是細(xì)胞周期重要的調(diào)節(jié)蛋白，升高的p21能夠與CyclinB1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Cdc2，而產(chǎn)生周期阻滯作用。 除了周期阻滯的作用外，芹菜素能夠有效的誘導(dǎo)T47D細(xì)胞株發(fā)生凋亡。 研究表明，線粒體膜電位的改變可以導(dǎo)致細(xì)胞色素c的釋放，進(jìn)而啟動(dòng)凋亡。而線粒體膜電位的改變與位于線粒體表面的凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2，Bcl-xl及Bax的相對(duì)含量有關(guān)。Bax/Bcl-2比率的增高被認(rèn)為是引起線粒體膜電位改變的始動(dòng)因素。本研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素能夠使凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2的表達(dá)減少，Bax的表達(dá)有所增加，提示芹菜素對(duì)T47D的凋亡誘導(dǎo)作用可能是通過(guò)影響B(tài)cl-2及Bax的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Western Blotting顯示，隨著芹菜素濃度的增加，Caspase3及PARP的剪切增加。而在時(shí)間梯度的Western Blotting結(jié)果中，Caspase3和PARP的剪切較濃度梯度有明顯的增強(qiáng)，提示適當(dāng)延長(zhǎng)芹菜素的作用時(shí)間比單純?cè)黾悠錆舛饶軌蚋鼮橛行У陌l(fā)揮芹菜素的抗腫瘤活性。 此外，Hochest/Mito-red/YO-PRO-1凋亡熒光染色以及流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡率的檢測(cè)均驗(yàn)證了芹菜素對(duì)凋亡的誘導(dǎo)作用。 我們通過(guò)YO-PRO-1/PI雙染的方法來(lái)檢測(cè)凋亡率。這是一種新型的凋亡檢測(cè)方法。YO-PRO-1能夠進(jìn)入凋亡或壞死的細(xì)胞，與其DNA交聯(lián)而使細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。正常細(xì)胞則可以通過(guò)胞吐作用將YO-PRO-1及時(shí)排出細(xì)胞外，而不能被染色。PI不能透過(guò)正常細(xì)胞膜，但在晚期凋亡或壞死的細(xì)胞中，細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，使PI進(jìn)入細(xì)胞。因而，該法與傳統(tǒng)的AnnexinV/PI雙染法相比，具有類似的結(jié)果和分析方法，同樣可以區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡，且所檢測(cè)的凋亡率與AnnexinV/PI雙染法有較好的平行度。該法的優(yōu)點(diǎn)是能夠使檢測(cè)的成本大大減少，有利于多次重復(fù)試驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 PI3K/Akt通路是乳腺癌細(xì)胞重要的通路，具有重要的生理功能，包括細(xì)胞生存，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，細(xì)胞的增殖及遷移等等。我們發(fā)現(xiàn)，芹菜素能夠抑制Akt的磷酸化，因此考慮芹菜素對(duì)T47D的增殖抑制作用可能與PI3K/Akt通路的抑制有關(guān)。據(jù)報(bào)道，Akt是細(xì)胞周期由G2期進(jìn)入M期的啟動(dòng)因素。Akt能夠抑制G2校檢點(diǎn)的功能，從而使細(xì)胞周期通過(guò)該校檢點(diǎn)。具體機(jī)制仍不清楚，有文獻(xiàn)報(bào)道，Akt能夠抑制Wee1的激酶活性，使得Cdc2含量增高，此外，還可能與Akt抑制Chk2的激活以及上調(diào)CyclinB1，Cdc2的表達(dá)相關(guān)。 總之，芹菜素能夠通過(guò)阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)凋亡等機(jī)制有效的抑制乳腺癌T47D細(xì)胞株的增殖，該過(guò)程可能與芹菜素抑制PI3K/Akt通路有關(guān)。且裸鼠皮下移植瘤模型進(jìn)一步驗(yàn)證了芹菜素在體內(nèi)的抗腫瘤效果。且有報(bào)道，芹菜素能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，且與多種化療藥聯(lián)合使用具有協(xié)同作用，從而降低化療藥的使用劑量，減少副作用。因而，芹菜素為乳腺癌的治療提供了一個(gè)新的策略，特別是芹菜素與化療藥物聯(lián)合治療乳腺癌來(lái)減少化療副作用等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，此有待進(jìn)一步的研究 。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 本文以乳腺癌T47D細(xì)胞系為研究對(duì)象，初步研究了芹菜素在體外和體內(nèi)條件下對(duì)T47D的增殖抑制作用。我們通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)，芹菜素能夠有效的抑制乳腺癌T47D細(xì)胞系的增殖，且具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性。而后進(jìn)一步證實(shí)芹菜素對(duì)該細(xì)胞系的增殖抑制作用是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及G2/M期阻滯來(lái)實(shí)現(xiàn)的，且與PI3K/Akt通路的抑制有關(guān)。最后，裸鼠皮下移植瘤模型的建立研究了芹菜素在體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 目前，乳腺癌的化療雖然明顯改善了乳腺癌患者的預(yù)后，但是化療的副作用卻限制了化療藥物的使用。芹菜素有別于其他的化療藥物，其能夠有效的抑制腫瘤細(xì)胞增殖，且副作用較小。有研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素和5-氟尿嘧啶聯(lián)用能夠減少5-氟尿嘧啶的使用劑量，從而明顯減少了化療的副作用。因此，本研究對(duì)乳腺癌的治療提供了一個(gè)新的思路。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 芹菜素是一種天然化合物，具有副作用小、致突變作用低等特點(diǎn)。研究表明，芹菜素具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期，抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移及化療增敏等多種抗腫瘤作用。而且芹菜素廣泛存在于多種水果和蔬菜中，因此，芹菜素在腫瘤治療，特別是在腫瘤的預(yù)防等方面具有非常好的應(yīng)用價(jià)值。
學(xué)術(shù)論文摘要
- [摘要] 目的：探討芹菜素對(duì)乳腺癌T47D細(xì)胞株的增殖抑制作用及對(duì)裸鼠皮下移植瘤的影響。方法：常規(guī)培養(yǎng)T47D細(xì)胞，通過(guò)MTT試驗(yàn)，克隆形成試驗(yàn)評(píng)價(jià)芹菜素對(duì)T47D細(xì)胞增殖的影響；Hochest/Mito-Red/YO-PRO-1凋亡熒光染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)芹菜素對(duì)T47D細(xì)胞周期的影響，以及凋亡率；Western Blotting用于檢測(cè)周期、凋亡的相關(guān)指標(biāo)，以及對(duì)PI3K/Akt通路的影響；裸鼠皮下移植瘤模型建立研究芹菜素在體內(nèi)的抗腫瘤效果。結(jié)果：MTT試驗(yàn)及克隆形成試驗(yàn)顯示芹菜素能夠抑制T47D細(xì)胞的增殖（p<0.05）；其能夠?qū)47D的細(xì)胞周期阻滯在G2/M期（p<0.05）；芹菜素能夠有效的誘導(dǎo)該細(xì)胞系凋亡，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；Western Blotting檢測(cè)芹菜素處理后p-Akt的含量明顯減少；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組移植瘤的增長(zhǎng)明顯小于對(duì)照組（p<0.05）。結(jié)論：芹菜素能夠使乳腺癌T47D細(xì)胞株的細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，并誘導(dǎo)其凋亡，在體內(nèi)體外均具有明顯的增殖抑制作用，其機(jī)制可能與PI3K/Akt通路的抑制相關(guān)。
獲獎(jiǎng)情況
- 無(wú)
鑒定結(jié)果
- 本研究中所有數(shù)據(jù)均真實(shí)有效
參考文獻(xiàn)
- [1]. Apigenin and cancer chemoprevention: progress, potential and promise (review). [2].Apigenin Induces Apoptosis through a Mitochondria/Caspase-Pathway in Human Breast Cancer MDA-MB-453 Cells. [3]. Apigenin causes G(2)/M arrest associated with the modulation of p21(Cip1) and Cdc2 and activates p53-dependent apoptosis pathway in human breast cancer SK-BR-3 cells. [4].Apigenin inhibited migration and invasion of human ovarian cancer A2780 cells through focal adhesion kinase. [5]. 5-Fluorouracil combined with apigenin enhances anticancer activity through induction of apoptosis in human breast cancer MDA-MB-453 cells. [6]. Involvement of nuclear factor-kappa B, Bax and Bcl-2 in induction of cell cycle arrest and apoptosis by apigenin in human prostate carcinoma cells. [7]. 用YO-PRO-1和PI聯(lián)合染色定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡. [8]. Exploiting the PI3K/AKT pathway for cancer drug discovery.
同類課題研究水平概述
- 研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素能夠?qū)⑷橄侔┘?xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G2-M期。Cdc2-Cyclin B復(fù)合物在細(xì)胞周期由G2期進(jìn)入M期的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。Cdc2-Cyclin B的激活與Cdc25c，Cdc25A磷酸酶介導(dǎo)的Cdc2在Tyr-15位點(diǎn)的磷酸化有關(guān)。Choi等研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素能夠使乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞中CDK1，Cyclin A及Cyclin B的表達(dá)下降，而CDK抑制因子P21cip1的表達(dá)卻明顯增加。流式細(xì)胞儀顯示芹菜素能夠?qū)K-BR-3細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G2-M期。此外，P53是阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要因子，研究發(fā)現(xiàn)，SK-BR-3細(xì)胞經(jīng)芹菜素處理后P53的表達(dá)明顯增加。P53蛋白能夠通過(guò)誘導(dǎo)P21cip1的表達(dá)而有效地阻滯細(xì)胞周期，控制細(xì)胞的增殖。 此外，芹菜素能夠通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞發(fā)生凋亡。ErbB2（Her2/neu）基因編碼一種185kb的跨膜糖蛋白，屬于表皮生長(zhǎng)因子家族，約25-30%的乳腺癌患者中能夠檢測(cè)到ErbB2的過(guò)表達(dá)。該基因的大量表達(dá)可以通過(guò)影響一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而促進(jìn)細(xì)胞的增殖并且降低了乳腺癌細(xì)胞對(duì)5-氟脲嘧啶化療的敏感性。Choi等研究顯示，5-氟脲嘧啶與芹菜素聯(lián)合使用與單用5-氟脲嘧啶相比，能夠更為明顯地抑制ErbB2的表達(dá)，因此二者的聯(lián)合具有協(xié)同作用。
