基本信息
- 項目名稱：
- 運用BALB/C小鼠肝癌逐級轉(zhuǎn)移模型評價復方苦參注射液療效
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術(shù)論文
- 簡介：
- 研究內(nèi)容：建立建立BALB/C小鼠分級轉(zhuǎn)移肝癌模型與復方苦參注射液療效分析。通過篩選具有持續(xù)增殖能力的腫瘤干細胞。以transwell實驗挑選具有遷移能力差異的細胞亞株。通過原位植入肝癌細胞的小鼠，進行體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的分離。原代分離及培養(yǎng)，腫瘤侵潤原位肝癌組織、淋巴結(jié)、肺部轉(zhuǎn)移灶、腹水。再次植入小鼠并重復4次，以達到分離轉(zhuǎn)移分化的目的。最后選出最大差異的兩亞株進行苦參注射液的療效評價。
- 詳細介紹：
- 工作方案： 1.從廣州中醫(yī)藥大學腫瘤實驗室獲得BALB/C小鼠H22肝癌細胞系。在無菌條件下，快速解凍，一般培養(yǎng)基+小牛血清混合液稀釋，并提取單細胞，數(shù)量為100個。 2.將10個腫瘤細胞放入同一培養(yǎng)管中。培養(yǎng)管經(jīng)行固態(tài)培養(yǎng)基覆蓋預處理。 3.待細胞增殖至形成“細胞群”時，分離挑取獨立細胞群，再次培養(yǎng)增殖，直至細胞數(shù)量約2*10^7時，停止培養(yǎng)，細胞亞株標號。 3.1若集合癌細胞所生成的生長刺激因子濃度不夠，目標細胞不增殖分裂，則將集合癌細胞快速生長期的培養(yǎng)液混合清潔小牛血清+培養(yǎng)基以1/2比例配成混合液，再培養(yǎng)細胞亞株。 4.保存細胞樣品，MTT法計數(shù)，定量細胞為10^6/ml。 5.分離、過濾腫瘤細胞株，做transwell實驗： 6.取出現(xiàn)遷移的次序為第一，最后的細胞亞株解凍，培養(yǎng)，分別標號為HL組。 7. 分離、過濾濃縮細胞至10^7/ml,備用。 8．普通級BALB/C小鼠表面，注射H22細胞亞株HL組于左肝葉，每組8只。 9.抗生素預防感染處理3天。 10．過程只觀察毛色，食量，飲水量，活動等。 11.5周后殺鼠 11.1頸脫臼處死小鼠，泡入75%的酒精消毒，移入超凈工作臺。 11.2腹部剪開皮膚，并剝皮。 11.3取腹水、肝原位腫瘤、周圍淋巴結(jié)（特別是腫大淋巴結(jié)）、肺組織。 11.4用等濃度分離法分離腹水細胞，抽取癌細胞，再培養(yǎng)，標號。 11.5取腫大淋巴結(jié)原代培養(yǎng)，標號。 11.6對肝原位腫瘤、周圍淋巴結(jié)、肺，做石蠟切片，計數(shù)癌細胞侵潤，分級。 11.6．1以《從基因組學到蛋白組學肝癌轉(zhuǎn)移分子機理的研究及臨床應用》中評級標準為參照標準。預實驗1次以獲得正確的殺鼠時間點。 12．取評級次序為第一，最后的細胞亞株再次種植到下一批次小鼠肝臟。（重復7-11步，重復3次）。共耗時約20周。共用鼠2組*每組4只*3批次=24只。 13.至最后一批次取評級次序為第一，最后的細胞亞株，分離原代培養(yǎng)腹水癌細胞，原代種植到第4批次小鼠（HL組*高中低*每組4只=48只），經(jīng)過2周，造模結(jié)束。 14.從第4批次小鼠種植癌細胞的第2周開始給腹腔注射給藥，連續(xù)注射21天。 15.殺鼠，取腹水、肝原位腫瘤、周圍淋巴結(jié)（特別是腫大淋巴結(jié)）、肺、胸腺、脾組織。 16.對肝原位腫瘤、周圍淋巴結(jié)、肺，做石蠟切片，計數(shù)癌細胞侵潤，分級。腹水總癌細胞計數(shù)。 17.數(shù)據(jù)統(tǒng)計，分析。統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)用x ± s 表示, 采用SPSS11 .0 統(tǒng)計軟件進行分析, 檢驗水準α= 0 . 05。 18.論文寫作
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的 觀察腫瘤在免疫壓力下轉(zhuǎn)移的分化，建立具有健全免疫的腫瘤分級轉(zhuǎn)移模型，為進一步研究免疫壓力在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程的分子演化中的作用奠定了基礎(chǔ)。 基本思路 目前抗腫瘤的方法，除了手術(shù)切除，大部分治療方式都有強烈的致畸作用，因此在抗腫瘤治療的過程中會不斷產(chǎn)生新的致癌因子，改變腫瘤的生物行為性質(zhì)。因此基于健全免疫的分級轉(zhuǎn)移模型，通過腫瘤轉(zhuǎn)移的行為篩選合適的抗腫瘤藥物，就能指導臨床抗腫瘤藥物的使用。
科學性、先進性及獨特之處
- 本文選擇具有健全免疫系統(tǒng)的BALB/C小鼠作為模型，其目的是為了觀察在自然狀態(tài)下腫瘤在免疫壓力下的轉(zhuǎn)移傾向，貼近臨床實際。 本文以建立逐級轉(zhuǎn)移非裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移模型為集成創(chuàng)新，并以此建立以轉(zhuǎn)移分化差異的研究平臺及藥物試驗平臺，可為臨床藥物使用提出指導性意見。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 建立肝癌同種異體移植，分級轉(zhuǎn)移模型，建立以非裸鼠，且具有免疫力的體內(nèi)逐級轉(zhuǎn)移模型。為進一步研究免疫壓力在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程的分子演化中的作用奠定了基礎(chǔ)。指導臨床的藥物應用。 改變實驗方法，其一，觀察腫瘤細胞在同種小鼠免疫健全的狀態(tài)下腫瘤侵潤的趨勢；其二，減少由手術(shù)應激引起的對小鼠機體對腫瘤細胞的免疫反應等的影響。 改良細胞培養(yǎng)增殖單細胞方法，降低實驗成本，并達到增殖單個腫瘤細胞的目的。
學術(shù)論文摘要
- 無
獲獎情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻
- 【參考文獻】 1. 湯釗猷 李雁 轉(zhuǎn)移性人肝癌模型系統(tǒng)建立及肝癌轉(zhuǎn)移研究應用 醫(yī)學研究雜志 2007-10； 36 （10） 2. 萬方軍 蔡健華 趙任 體內(nèi)連續(xù)篩選法建立人結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移階梯細胞模型 《外科理論與實踐》2009；14（6）：633-638 3. 楊敏 楊朝暉 侯致典 李學農(nóng) 體內(nèi)連續(xù)篩選法建立可視化乳腺癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型 《南方醫(yī)科大學學報》2008；28（6）：944-947 4. 張玉俠 朱秀 王金萍 體內(nèi)外連續(xù)篩選建立人前列腺癌高轉(zhuǎn)移細胞亞系及其生物學特性《安徽醫(yī)科大學學報》2009-4；44（2）：173-176 5. 脫朝偉 劉秋珍 張寧 楊波 王明耀 體內(nèi)連續(xù)篩選法建立人原發(fā)性小腸惡性淋巴瘤裸鼠原位移植肝轉(zhuǎn)移模型《解放軍醫(yī)學雜志》2007-9；32（9）：926-929 6. 李雁 湯釗猷 葉勝龍 劉銀坤 陳潔 體內(nèi)連續(xù)篩選法建立自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移人肝癌細胞系《中華醫(yī)學雜志》2002-5-10；82（9）：601-605 7. 湯釗猷 高轉(zhuǎn)移人肝癌裸鼠模型和細胞系的建立、研究與應用醫(yī)學研究通訊2003；32（9）：16-17 8. 韓克起, 顧偉 小鼠肝癌原位移植模型的建立及生物學特性 中西醫(yī)結(jié)合學報2004 -9 ；2（5 ）： 372-374 9．張萌，胡少為，姜桔紅，文劍明 梯度密度離心法分離肝癌細胞及其轉(zhuǎn)移性細胞株的建立 2007-11；28（6）：670-671 10. 代志軍 高潔 復方苦參注射液對胃癌SGC-7901細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響 中藥材2007-7；30（7）：815-819 11. 葉正青 梁重峰 復方苦參注射液對人肝癌SMMC-7721腫瘤細胞作用的實驗研究 山東醫(yī)藥 2009； 49(16) ：44-45 12. 李芮 杜健鵬 侯仰韶 復方苦參注射液對SGC-7901,HepG2和BEL-7402腫瘤細胞作用的實驗研究 腫瘤研究與臨床 2006 ；18(1) ：8-10 13. 林麗珠 周岱翰 復方苦參注射液對肺癌和肝癌細胞抑瘤作用研究中藥新藥與臨床藥理2009-1； 20（1）：21-23
同類課題研究水平概述
- 同類研究： 一、模型的建立 目前這種體內(nèi)連續(xù)篩選法建立腫瘤模型都是以裸鼠為實驗模型，具有基因?qū)W的明顯優(yōu)勢。該模型系統(tǒng)的裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移特點表明，隨著特定器官轉(zhuǎn)移篩選次數(shù)的增加，瘤細胞對該器官的定向轉(zhuǎn)移能力逐漸增強，同時也出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移方向的泛化趨勢，這是一個自發(fā)性轉(zhuǎn)移力由弱到強、由單向轉(zhuǎn)移到多向轉(zhuǎn)移的動態(tài)模型系統(tǒng)，有非常明顯的表型差異，有利于探索其背后的分子機制?！?】 已經(jīng)建立的模型種類有人結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移【2】，可視化乳腺癌肝轉(zhuǎn)移【3】，人前列腺癌高轉(zhuǎn)移【4】，人原發(fā)性小腸淋巴瘤裸鼠原位移植肝轉(zhuǎn)移模型【5】，自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移人肝癌模型篇【6】。雖然裸鼠實驗的在理論上具有的優(yōu)勢相當明顯，但是實驗條件比較高，需要無菌環(huán)境或SPF。 基礎(chǔ)的理論方法是湯釗猷【6】最早提出，體內(nèi)連續(xù)篩選法，并建立了LCI．D20【7】，MHCC97，MHCC97-L等不同的轉(zhuǎn)移模型。 基礎(chǔ)的實驗方法參考韓克起【8】的實驗數(shù)據(jù)，建立相關(guān)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，為本實驗提供成本的相關(guān)信息。 實驗所需的梯度密度離心法分離肝癌細胞是現(xiàn)實可行，容易操作的實驗方法【9】。 二、復方苦參注射液的臨床價值 復方苦參注射液在臨床上已經(jīng)使用了10年余，是臨床上有效的抗腫瘤中成藥物，是具有中醫(yī)特色的治療手段，為拒絕放化療及手術(shù)治療的患者提供治療手段，學術(shù)文獻以臨床觀察為主，證明了復方苦參注射液在抗腫瘤治療上有廣泛的抗癌譜，聯(lián)合化療治療中晚期惡性腫瘤能減輕毒副反應、提高近期療效和患者生存質(zhì)量。 但是由于臨床條件，苦參注射液的應用主要是以常規(guī)化療為基礎(chǔ)，以輔助用藥的角色在臨床上應用，未能體現(xiàn)出苦參注射液單藥對腫瘤實體作用，因此單藥臨床藥物研究的文獻相對較少。 復方苦參注射液在細胞組織學方面的研究相對較少，但是也是復方苦參注射液單藥對腫瘤細胞的作用研究相對集中的領(lǐng)域，現(xiàn)已證明了復方苦參注射液對胃癌SGC-7901【10】，人肝癌SMMC-7721【11】有促調(diào)亡和誘導細胞凋亡的作用。同時復方苦參注射液也對HepG2和BEL-7402【12】，肺癌LAC、Lewis細胞,肝癌Hep、H22腫瘤細胞均有體內(nèi)、外的抑瘤效果【13】。 利用體內(nèi)連續(xù)篩選法是一個較為新型的腫瘤模型，對腫瘤的病理發(fā)展具有理論的優(yōu)勢，明確了腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在能力，為抗腫瘤藥物干預存在轉(zhuǎn)移潛能差異的細胞提供一個平臺。
