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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 槲皮素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡及Caspase-3、-8活化對凋亡影響的研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 采用噻唑藍(lán)（MTT）法觀察槲皮素對人宮頸癌HeLa細(xì)胞和正常人肝L-02細(xì)胞的生長抑制作用；DAPI染色觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；DNA瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA片段化分析，熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況；比色法測定細(xì)胞凋亡過程中caspase-3、-8活性變化。本研究可為進(jìn)一步探索槲皮素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供理論線索，并且為研制新型具有抗腫瘤作用藥物奠定基礎(chǔ)。
- 詳細(xì)介紹：
- 隨著人類生態(tài)環(huán)境的日益惡化，腫瘤已經(jīng)成為人類的主要?dú)⑹?。而宮頸癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌位居第二，每年全球死于宮頸癌的婦女約有20萬，中國占10%左右。在發(fā)展中國家，尤其是亞洲、南美洲、非洲的一部分地區(qū)，宮頸癌則屬于常見并多發(fā)的婦科腫瘤，并且，宮頸癌發(fā)病率逐年上升，趨于年輕化。在我國宮頸癌的分布主要在中部地區(qū)，且農(nóng)村高于城市，山區(qū)高于平原，農(nóng)業(yè)人口高于非農(nóng)業(yè)人口；從內(nèi)蒙古、山西、陜西、湖北、湖南到江西，形成一個高發(fā)地帶。從人群年齡分布來看，在20歲以前，宮頸癌的發(fā)病率較低；20～50歲增長較快，其后上升輻度較緩。我國普查發(fā)現(xiàn)的宮頸癌發(fā)病年齡多為40～55歲，60～69歲又有高峰出現(xiàn)。在臨床上，宮頸癌的常規(guī)治療方法包括外科手術(shù)切除、放射線治療以及化學(xué)治療等方法；對Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的患者均不宜手術(shù)治療，手術(shù)后也容易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，并且放療和化療對人體的副作用也相對較大，這使人們更深刻地認(rèn)識到開發(fā)具有良好抗癌作用藥物的重要性和緊迫性。因此，及早預(yù)防、治療宮頸癌，尋找一種切實(shí)有效的抗腫瘤藥物（尤其以中草藥為首選），是擺在每位科研工作者面前的重要任務(wù)。我國地大物博，具有豐富的中草藥資源，研究具有抗腫瘤活性的中草藥，更具社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。 槲皮素（Quercetin）是一種自然界存在的黃酮類化合物（化學(xué)名為3，3’，4’，5，7-五羥基黃酮），廣泛存在于自然界各種植物的花、葉和果實(shí)之中，也是人類飲食中最主要的生物類黃酮。在芒果、蘋果、葡萄、櫻桃、梨、等植物中，均富含這一物質(zhì)，在我國資源十分豐富，易于提取、分離和檢測。 槲皮素是一種黃色粉末狀固體或晶體，分子中有5個酚羥基，呈弱酸性，在酸性條件下可穩(wěn)定存在，在堿性條件下不穩(wěn)定，很快轉(zhuǎn)化為有機(jī)醌化合物，使其穩(wěn)定性下降。高氧環(huán)境、金屬離子等也可以影響其穩(wěn)定性。以大豆蛋白、乙基纖維素、單硬脂酸甘油酯作為復(fù)合壁材，將槲皮素制成微膠囊產(chǎn)品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微膠囊化可以明顯提高槲皮素穩(wěn)定性，并減弱pH的影響和氧氣對槲皮素的氧化降解。槲皮素分子呈平面結(jié)構(gòu)，晶體以平面緊密重疊堆積，導(dǎo)致其雖然有5個羥基，但卻幾乎不溶于水，極大地限制了其在體內(nèi)的吸收和生物利用度，可能由于其空間結(jié)構(gòu)的原因較難通過胃腸道黏膜。有研究表明，將槲皮素制成水溶性的前體藥物，志愿者口服給藥，在其血液中并未測到槲皮素或其在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物葡萄糖醛酸酯或硫酸酯化物，說明該水溶性的前體并不能改善槲皮素的口服吸收，而且進(jìn)行化學(xué)修飾后的槲皮素結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，降低了其抗腫瘤的效果。因此，提高槲皮素的溶解度，增加其口服吸收，提高生物利用度是槲皮素應(yīng)用中亟待解決的問題。 槲皮素對人體具有十分重要的生理作用，如擴(kuò)張冠狀動脈、降低毛細(xì)血管通透性和脆性、降血脂、抗血小板聚集、抗炎抗病毒、抗過敏、鎮(zhèn)痛、抗氧化清除自由基、調(diào)節(jié)免疫功能等作用[1,2]。自1971年NCL首次發(fā)現(xiàn)槲皮素對P388白細(xì)胞具有抑制作用以來，國內(nèi)外學(xué)者十分關(guān)注槲皮素的抗腫瘤作用。近年來研究表明，槲皮素對膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、白血病等多種腫瘤細(xì)胞的增殖也具有明顯的生長抑制作用，呈現(xiàn)出一定的抗腫瘤效應(yīng)[3-7]，槲皮素對腫瘤的化學(xué)預(yù)防和治療作用格外引人矚目，其可以全面地作用于癌發(fā)生的始發(fā)、促癌和演進(jìn)3個階段，兼有抗致癌、抗促癌和誘導(dǎo)分化的作用。 研究表明，腫瘤的始發(fā)起因于細(xì)胞受到致癌因素的多次攻擊，DNA受損而發(fā)生突變，國際癌癥中心曾指出，80％-90％的人類腫瘤是由化學(xué)致癌物引起的。在環(huán)境中廣泛存在的多環(huán)芳烴、芳香胺類、亞硝胺及黃曲霉毒素等都為間接致癌物(或稱為致癌前體物)。對腫瘤的化學(xué)預(yù)防則是指用藥物抑制腫瘤的發(fā)生或使腫瘤分化逆轉(zhuǎn)，天然的化合物槲皮素也可作為化學(xué)預(yù)防劑，可以通過抑制間接致癌物活化所需的以細(xì)胞色素P450為主的微粒體混合功能氧化酶以及其它毒物代謝酶，從而使它們不能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)性質(zhì)活潑的終致癌物，進(jìn)而阻止細(xì)胞癌變的發(fā)生。并且，槲皮素是有效的抗氧劑，通過阻斷細(xì)胞膜脂類的過氧化過程，而減輕氧自由基對細(xì)胞的損害，保持細(xì)胞的正常狀態(tài)。在槲皮素對腫瘤的治療作用方面，目前已有體外實(shí)驗(yàn)研究報道，槲皮素能顯著抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，如：人卵巢癌細(xì)胞、多種胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人黑色素瘤細(xì)胞等。但槲皮素對人宮頸癌HeLa細(xì)胞的抗腫瘤的研究雖有少量報道，但大多停留在槲皮素對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用層面，對某些信號分子的調(diào)控研究也尚末涉及。因此，深入了解槲皮素對腫瘤細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制，對進(jìn)一步開發(fā)新型具有抗腫瘤作用的中藥具有重要而深遠(yuǎn)的意義。 本作品我們擬人宮頸癌HeLa細(xì)胞為藥物作用模型，觀察槲皮素對HeLa細(xì)胞的生長抑制、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及caspase-3、-8活性變化對凋亡的影響，為進(jìn)一步探索槲皮素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供理論線索。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：研究槲皮素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞）凋亡的作用，以及caspase-3、-8活化對凋亡的影響；揭示槲皮素誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡機(jī)制及涉及的細(xì)胞凋亡的caspase途徑，以探討中草藥槲皮素的抗腫瘤作用；并利用我國豐富的中藥材資源，開發(fā)成中草藥抗腫瘤制劑。 基本思路：1、槲皮素體外抗腫瘤作用；2、槲皮素在動物體內(nèi)抗腫瘤生長的抑制作用；3、槲皮素固體脂質(zhì)納米粒制劑研究。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 觀察槲皮素對HeLa細(xì)胞和正常人肝細(xì)胞株（L-02）的生長抑制作用，并比較分析；采用定性和定量試驗(yàn)檢測細(xì)胞凋亡情況及凋亡過程中caspase-3、-8活性變化，從而全面、系統(tǒng)、科學(xué)地確定槲皮素可特異性地誘導(dǎo)人HeLa細(xì)胞凋亡及其誘導(dǎo)凋亡機(jī)制；并將建立人宮頸癌小鼠模型，進(jìn)一步闡述槲皮素對荷瘤小鼠移植瘤生長抑制作用，確定其在體內(nèi)的抗腫瘤活性及藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)，為新型抗腫瘤藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實(shí)意義
- 本作品明確了槲皮素可成功誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，并可通過激活caspase途徑來完成腫瘤細(xì)胞凋亡過程，同時建立了槲皮素作為中藥產(chǎn)生的抗腫瘤作用的檢測和分析方法，在槲皮素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡機(jī)制及相關(guān)凋亡信號分子活化的研究領(lǐng)域，屬國內(nèi)、外首創(chuàng)。本項(xiàng)目已與浙江得恩德制藥有限公司簽訂《槲皮素中藥抗腫瘤制劑開發(fā)》項(xiàng)目合作意向書，下一步將進(jìn)行小鼠體內(nèi)荷瘤試驗(yàn)、槲皮素固體脂質(zhì)納米粒研究開發(fā)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的：研究槲皮素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的作用，以及caspase-3、-8活化對凋亡的影響。方法：采用噻唑藍(lán)（MTT）法觀察槲皮素對HeLa細(xì)胞和L-02細(xì)胞的生長抑制作用；DAPI染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA片段化分析，熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況；比色法測定細(xì)胞凋亡過程中caspase-3、-8活性變化。結(jié)果：MTT結(jié)果顯示，槲皮素可選擇性抑制HeLa細(xì)胞的生長，并呈劑量、時間依賴性，而L-02細(xì)胞不出現(xiàn)生長抑制。160.0μmol?L-1槲皮素處理HeLa細(xì)胞72 h，DAPI染色見核濃縮及邊緣現(xiàn)象，DNA電泳出現(xiàn)特征性凋亡條帶。160.0μmol?L-1槲皮素處理HeLa細(xì)胞24h、48h和72h的凋亡率分別為（9.4±2.1）%、（30.1±6.5）%和（59.8±9.5）%，caspase-3活性在48h達(dá)最高（1.68±0.07）U?μg-1，而caspase-8活性則在24h達(dá)最高（1.83±0.06）U?μg-1，兩者與對照組相比均有顯著性差異。結(jié)論：槲皮素可特異性地誘導(dǎo)人HeLa細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)凋亡機(jī)制可能與caspase-3、-8活化有關(guān)。
獲獎情況
- 本作品于2011年4月《中國藥學(xué)雜志》第46卷第8期上發(fā)表。
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- 1. MENG D S, WANG S L. Antitumor effect of quercetin[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs(中草藥), 2001, 32(2): 186-188. 2. ZHAI Y Y, ZHOU L, LAI Y H. Research of quercetin on Antitumor activit[J]. Journal of Modern Clinical Medical Bioengineering(現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)雜志),2005, 11(1): 18-20. 3. MEDIERO JM, ALONSO A, BORDA A, et al. Effect of polyphenols from the Mediterranan diet on proliferation and mediators of in vitro invasiveness of the MB-49 murine bladder cancer cell line[J].Actas Urol Esp, 2005, 29(8): 743-749. 4. CHEN W S, WANG X, ZHUANG J G, et al. Induction of death receptor 5 and suppression of survivin contribute to sensitization of TRAIL-induced cytotoxicity by quercetin in non-small cell lung cancer cells[J]. Carcinogenesis, 2007, 28(10): 2114 - 2121. 5. FAIY H, PSAHOULIA, KONSTANTINOS G, et al. Quercetin enhances TRAIL-mediated apoptosis in colon cancer cells by inducing the accumulation of death receptors in lipid rafts[J].Mol Cancer Ther, 2007, 6(9): 2591 - 2599.
同類課題研究水平概述
- 槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，廣泛存在于植物界，山楂、洋蔥等含量較高。槲皮素具有多種生物學(xué)活性，如擴(kuò)張冠狀動脈、降低毛細(xì)血管通透性和抗腫瘤等多種藥理作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素不僅對多種致癌物、促癌物和致癌劑有拮抗作用，而且對多種惡性腫瘤細(xì)胞有生長抑制作用。如人卵巢癌細(xì)胞、多種胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞等。據(jù)文獻(xiàn)報道：槲皮素能抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，促機(jī)體正常細(xì)胞分化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 宮頸癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，每年全球死于宮頸癌的婦女有20萬。并且，宮頸癌發(fā)病率逐年上升，使人們更深刻地認(rèn)識到開發(fā)具有良好抗癌作用藥物的重要性和緊迫性。槲皮素在我國資源十分豐富，成為具有抗腫瘤作用的藥物也頗有希望。但目前對槲皮素的研究尚存不足：雖然多數(shù)研究證實(shí)槲皮素的抗腫瘤效果，但也有個別實(shí)驗(yàn)室得出槲皮素可能促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的結(jié)果，對某些信號分子的調(diào)控研究也不盡相同。因此，深入了解槲皮素對腫瘤細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制，對進(jìn)一步開發(fā)新型具有抗腫瘤作用的中草藥具有重要而深遠(yuǎn)的意義。 目前，槲皮素的抗腫瘤作用機(jī)制有以下可能：首先，槲皮素可以抑制原癌基因c-fos、c-jun和ras癌基因的表達(dá)，由于P21ras在ras-raf-MAPK 信號通路中起著重要作用，可在翻譯水平上抑制突變型P53蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞停滯在G2-M 期，阻止新合成的P53蛋白聚集；其次，槲皮素可下調(diào)阻遏熱休克蛋(heatshockpretein，HSP)的基因轉(zhuǎn)錄水平及HPV18 E7、P16 mRNA表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；也可能通過激活細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號傳導(dǎo)通路，最終通過線粒體途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；此外，槲皮素還可增加轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGFβ1)的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞分泌大量的TGFβ1，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并參與了腫瘤細(xì)胞增生和分化的調(diào)節(jié)，且呈明顯的劑量依賴性；再則，槲皮素還可減少腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞分裂的延遲，從而將腫瘤細(xì)胞阻滯于不同的細(xì)胞周期，如人的胃癌、結(jié)腸癌細(xì)胞的生長可被阻滯于G1/S的分界處，人白血病的T細(xì)胞可被阻滯于G1晚期，HL60、MCF-7細(xì)胞可被阻滯于G2/M 期，同時也可介導(dǎo)抑制PI3K-Akt/PKB途徑等等。因此，深入了解槲皮素的抗腫瘤作用機(jī)制，必將進(jìn)一步推動我國對中草藥抗腫瘤活性研究的深入。
