基本信息
- 項目名稱：
- 大腸桿菌內(nèi)基因計時開關(guān)的設(shè)計及應用
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 科技發(fā)明制作A類
- 簡介：
- 大腸桿菌內(nèi)基因計時開關(guān)的設(shè)計及應用 分類：科技發(fā)明制作，D類 摘要： 大腸桿菌是目前應用最為廣泛的外源蛋白表達體系，該體系通常采用單一啟動子調(diào)控目的蛋白表達，這種調(diào)控往往是一不可逆過程。而生物體內(nèi)有許多蛋白只在一段時間內(nèi)進行表達的，因而建立一種簡單可控的基因開關(guān)模型，對研究這些蛋白的表達與功能具有重要意義。 本發(fā)明設(shè)計了一種“基因計時開關(guān)”用以控制大腸桿菌在某一時段內(nèi)表達特定目的蛋白。基因計時開關(guān)是一個由阿拉伯糖操縱子和乳糖操縱子組成的基因反饋調(diào)節(jié)回路，模型中以綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白(RFP)為報告基因，顯示其工作狀態(tài)（見項目圖片1)。 當培養(yǎng)基中沒有阿拉伯糖時，阿拉伯糖操縱子處于阻遏狀態(tài)，乳糖操縱子控制RFP表達，開關(guān)處于“關(guān)閉”狀態(tài)；當培養(yǎng)基中加入阿拉伯糖后，阿拉伯操縱子解阻遏啟動GFP表達，顯示開關(guān)打開。同時表達LacI阻遏乳糖操縱子，關(guān)閉RFP的表達。當阿拉伯糖完全降解后，基因計時開關(guān)重新關(guān)閉。 該發(fā)明于2008年11月8～9日在由美國麻省理工學院主辦的國際基因工程機器設(shè)計競賽（iGEM）中獲得銅獎。
- 詳細介紹：
- 大腸桿菌內(nèi)基因計時開關(guān)的設(shè)計及應用 摘要： 利用合成生物學的方法，在大腸桿菌中構(gòu)造一個穩(wěn)定、可控的“基因計時開關(guān)”，通過本發(fā)明設(shè)計，基因生物計時開關(guān)可以對大腸桿菌外的L-阿拉伯糖分子濃度信號做出響應，從而實現(xiàn)對計時開關(guān)的定時控制。這一發(fā)明可以調(diào)控大腸桿菌在某一特定時段內(nèi)表達特定目的蛋白，不僅可以用于對瞬時表達蛋白質(zhì)的功能研究，也在工業(yè)發(fā)酵中利用大腸桿菌對外界調(diào)控因素的響應實現(xiàn)精密的自我調(diào)控。 大腸桿菌作為外源基因表達的宿主，遺傳背景清楚，培養(yǎng)條件簡單，操作方法簡便，是目前生物技術(shù)領(lǐng)域應用最為廣泛的表達體系。用大腸桿菌表達外源性蛋白的時候，通常采用單一啟動子進行調(diào)控，即：當大腸桿菌生長到一定時期，加入誘導劑或改變外界環(huán)境因素，誘導目的基因的表達。但這種調(diào)節(jié)往往是單向的，不可逆的過程。而生物體內(nèi)有許多蛋白的表達是時序性的，即：只在特定條件下，或特定時間段內(nèi)進行表達。因而，建立一種簡單可控的基因開關(guān)模型，對研究這些瞬時表達的蛋白質(zhì)的功能具有重要意義。 為了使大腸桿菌內(nèi)的外源蛋白能進行可調(diào)控的時序表達，我們設(shè)計了一種“基因計時開關(guān)”，這種計時開關(guān)可以控制大腸桿菌在某一特定時段內(nèi)表達特定目的蛋白，可以用于對瞬時表達蛋白質(zhì)的功能研究。 基因計時開關(guān)其基本組成如圖1所示（見項目圖片1）： 其中：araC+PBAD為阿拉伯糖操縱子，LacI為乳糖操縱子的調(diào)節(jié)基因，PL是乳糖啟動子，GFP為綠色熒光蛋白，RFP為紅色熒光蛋白。 根據(jù)上述目的基因構(gòu)建“基因計時開關(guān)”的質(zhì)粒圖譜如圖2所示(見項目圖片2)，其工作原理是在大腸桿菌中構(gòu)建一個由阿拉伯糖操縱子和乳糖操縱子組成的基因反饋調(diào)節(jié)回路，同時以綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白(RFP)為報告基因，顯示基因計時開關(guān)的工作狀態(tài)。 基因計時開關(guān)主要工作原理是以可以解除阿拉伯糖操縱子阻遏狀態(tài)的阿拉伯糖作為調(diào)控分子，控制計時器的開關(guān)狀態(tài)和工作時間。當培養(yǎng)基中沒有加入L-阿拉伯糖時，阿拉伯糖操縱子處于阻遏狀態(tài)，乳糖操縱子控制RFP的表達，表明基因計時器處于“未計時”狀態(tài)；當在培養(yǎng)基中加入一定濃度的L-阿拉伯糖后，阿拉伯操縱子解阻遏，調(diào)節(jié)基因LacI表達，使乳糖操縱子受到阻遏，抑制RFP的表達，同時阿拉伯糖啟動子啟動GFP的表達，顯示計時開關(guān)開始計時。當培養(yǎng)基中L-阿拉伯糖完全降解后，阿拉伯糖操縱子重新回到阻遏狀態(tài)，阻斷GFP的表達，乳糖啟動子再次啟動RFP的表達，此時基因計時器完成計時工作。 報告基因的表達順序和狀態(tài)如下圖所示(見項目圖片5)： 同時，我們可以通過調(diào)節(jié)L-阿拉伯糖的濃度來調(diào)控基因計時開關(guān)工作時間的長短，從而達到為計時開關(guān)定時的目的。另外，在基因計時開關(guān)工作過程中，菌體培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)基的成分也會對計時周期的長短產(chǎn)生影響。在實際應用中，可以用某些目的基因替換GFP和RFP報告基因，從而使不同蛋白在大腸桿菌內(nèi)進行可控的順序表達。 本發(fā)明可以使大腸桿菌內(nèi)的外源蛋白能進行可調(diào)控的時序表達，可用于研究瞬時表達蛋白質(zhì)的功能。此外，也可利用大腸桿菌對外源調(diào)控分子的響應，實現(xiàn)工業(yè)發(fā)酵中的自響應式的自動控制。
作品圖片
作品專業(yè)信息
設(shè)計、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標
- 設(shè)計目的：大腸桿菌作為外源基因表達的宿主，遺傳背景清楚，培養(yǎng)條件簡單，操作方法簡便，是目前生物技術(shù)領(lǐng)域應用最為廣泛的表達體系。為了使大腸桿菌內(nèi)的外源蛋白能進行可調(diào)控的時序表達，我們設(shè)計了一種“基因計時開關(guān)”，這種計時開關(guān)可以控制大腸桿菌在某一特定時段內(nèi)表達特定目的蛋白，不僅可以用于對瞬時表達蛋白質(zhì)的功能研究，也在工業(yè)發(fā)酵中利用大腸桿菌對外界調(diào)控因素的響應實現(xiàn)精密的自我調(diào)控。 基本設(shè)計思路：“基因計時開關(guān)”的工作原理是在大腸桿菌中構(gòu)建一個由阿拉伯糖操縱子和乳糖操縱子組成的基因反饋調(diào)節(jié)回路，同時以綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白(RFP)為報告基因，顯示基因計時開關(guān)的工作狀態(tài)。通過調(diào)節(jié)L-阿拉伯糖的濃度來調(diào)控基因計時器工作時間的長短，從而達到為計時器定時的目的；另外菌體培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)基成分也對基因計時器工作時間的長短有影響。在實際應用中，可以用某些目的基因替換GFP和RFP報告基因，從而使不同蛋白在大腸桿菌內(nèi)進行可控的順序表達，用于某些蛋白質(zhì)瞬時表達模型的研究。 創(chuàng)新點：利用兩個精密調(diào)控的操縱子使大腸桿菌內(nèi)目的基因能進行時序調(diào)控性表達，并使之能夠?qū)ν饨缯{(diào)控分子做出響應，可根據(jù)需要控制目標蛋白實現(xiàn)一定時段的定時表達。這一調(diào)控模型可用于某些瞬時表達蛋白的功能研究，同時也可用于大腸桿菌發(fā)酵表達的自動控制。 技術(shù)關(guān)鍵：通過阿拉伯糖操縱子和乳糖操縱子構(gòu)建一個精密調(diào)控的反饋回路，利用阿拉伯糖操縱子精密調(diào)控、易于誘導的性質(zhì)實現(xiàn)目的蛋白的時序性表達。
科學性、先進性
- 目前，大部分利用大腸桿菌對目的蛋白的表達的調(diào)控手段是利用單一啟動子進行調(diào)控，在加入某種誘導劑后誘導蛋白表達，但這種誘導表達通常是單向的、不可逆的。 本發(fā)明利用了兩個精密調(diào)控的啟動子，通過反饋回路實現(xiàn)了目的蛋白表達的時序性調(diào)控，使目的蛋白可以在一段可控的時間段內(nèi)進行表達，并可以在大腸桿菌的生長周期內(nèi)重復開關(guān)此目的蛋白的表達。此模型不僅可以用于大腸桿菌發(fā)酵過程的控制，也可用于某些瞬時表達的蛋白質(zhì)功能的研究。
獲獎情況及鑒定結(jié)果
- 該作品于2008年11月8～9日在由美國麻省理工學院（Massachusetts Institute of Technology，MIT）主辦的國際基因工程機器設(shè)計競賽（International Genetically Engineered Machine Competition，iGEM）中獲得銅獎
作品所處階段
- 實驗室階段
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
作品可展示的形式
- 圖片
使用說明,技術(shù)特點和優(yōu)勢,適應范圍,推廣前景的技術(shù)性說明,市場分析,經(jīng)濟效益預測
- 本發(fā)明的主要技術(shù)優(yōu)勢是實現(xiàn)了大腸桿菌發(fā)酵過程中目的蛋白表達的時序性控制。使目的蛋白可以在一段可控的時間段內(nèi)進行表達，并可以在大腸桿菌的生長周期內(nèi)重復開關(guān)此目的蛋白的表達。 本發(fā)明一方面可以用于大腸桿菌發(fā)酵過程的控制，利用大腸桿菌對調(diào)控分子的響應，實現(xiàn)自響應式的表達調(diào)控，在工業(yè)發(fā)酵的自動控制中能獲得良好的應用前景。同時，本發(fā)明也可用于建立某些瞬時表達的蛋白質(zhì)功能研究的模型，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究提供了一種有效而方便的基因調(diào)控模型。
同類課題研究水平概述
- 合成生物學是新出現(xiàn)的一門交叉學科，具有迅猛的發(fā)展勢頭和廣闊的發(fā)展前景。它借鑒工程化的思想來研究生命，最終目標是創(chuàng)造人工生命體，涵蓋分子生物學、工程學、數(shù)學、物理學等許多研究領(lǐng)域。 在國外合成生物學的研究受到科技發(fā)達國家的高度重視，在美國和瑞士已成功地召開了三屆國際合成生物學會議, 歐洲首屆合成生物學會議也于2007年底在西班牙成功召開, 著名的美國洛倫茲?貝克萊國家實驗室在國際上首次建立了合成生物學部等等。2000年以來, 國外的合成生物學取得了很大進展, 2004年“合成生物學”被美國MIT出版的Technology Review評為將改變世界的10大新出現(xiàn)的技術(shù)之一。例如有學者利用基因表達調(diào)控元件構(gòu)成了生物邏輯門、振蕩器、反饋回路等組件。有學者根據(jù)細胞外部或內(nèi)部某些特定參數(shù)的變化來控制細胞的生長、分化和代謝等生命活動的設(shè)計實現(xiàn)了非天然的信號轉(zhuǎn)導。You等設(shè)計的對菌體密度敏感的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)能導致細菌死亡,從而實現(xiàn)對大腸桿菌生長密度的調(diào)控。麻省理工學院的研究人員獲得了能對不同光照條件做出應答的大腸桿菌。利用代謝工程技術(shù)改造細胞代謝途徑來合成復雜化合物的方法,將大大降低藥品或者材料的生產(chǎn)成本,直接造福大眾。例如, Keasling等向大腸桿菌中導入了來自苦艾草、釀酒酵母等其他物種的10個基因,改造后的代謝系統(tǒng)表達出了能治療瘧疾的青蒿素等類萜類化合物。 相對于國外對合成生物學的重視程度,國內(nèi)的合成生物學的發(fā)展才剛剛起步，中國科學院合成生物學重點實驗室于2009年2月2日正式獲批在上海成立，國內(nèi)在該領(lǐng)域還沒有相關(guān)研究成果的報道，從國內(nèi)中文期刊數(shù)據(jù)庫以“ 合成生物學”為關(guān)鍵詞只有幾篇綜述短文。合成生物學有巨大的理論研究價值和實際應用價值,其試驗成果將會產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益,具有廣闊的應用前景。 本發(fā)明利用合成生物學的方法，在大腸桿菌中構(gòu)造一個穩(wěn)定、可控的“基因計時開關(guān)”，通過本發(fā)明設(shè)計，基因生物計時開關(guān)可以對大腸桿菌外的L-阿拉伯糖分子濃度信號做出響應，從而實現(xiàn)對計時開關(guān)的定時控制。這一發(fā)明可以調(diào)控大腸桿菌在某一特定時段內(nèi)表達特定目的蛋白，不僅可以用于對瞬時表達蛋白質(zhì)的功能研究，也在工業(yè)發(fā)酵中利用大腸桿菌對外界調(diào)控因素的響應實現(xiàn)精密的自我調(diào)控。
