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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 基于熒光蛋白標(biāo)簽的“夾心法”重組蛋白生產(chǎn)分離純化系統(tǒng)
- 來(lái)源：
- 第十一屆“挑戰(zhàn)杯”國(guó)賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 大類：
- 科技發(fā)明制作B類
- 簡(jiǎn)介：
- 我們發(fā)明的蛋白表達(dá)純化系統(tǒng)是一種基于熒光蛋白的“夾心法”標(biāo)簽表達(dá)純化系統(tǒng)。本發(fā)明的蛋白表達(dá)純化系統(tǒng)，是將目的蛋白的兩端，在N端連接一個(gè)新型熒光蛋白sGFP標(biāo)簽，在C端連接上一個(gè)組氨酸His短肽，并加有多核苷酸酶切位點(diǎn)，蛋白全長(zhǎng)融合表達(dá)。同時(shí)可以根據(jù)需要在目的蛋白與標(biāo)簽之間加入蛋白酶切位點(diǎn)。該系統(tǒng)的目的蛋白表達(dá)效率能夠得到改進(jìn)，提高目的蛋白產(chǎn)率，全長(zhǎng)蛋白在可見(jiàn)光下為綠色，可以實(shí)施監(jiān)測(cè)蛋白表達(dá)效果、純化過(guò)程；僅通過(guò)肉眼監(jiān)視蛋白的表達(dá)效率、斷裂程度及純化流程。
- 詳細(xì)介紹：
- 熒光蛋白有許多優(yōu)良特性,如非外源因子依賴發(fā)光,無(wú)種屬依賴性,非常高的穩(wěn)定性,對(duì)生物體無(wú)毒性,可傳代進(jìn)行遺傳分析,因而熒光蛋白在遺傳學(xué),發(fā)育生物學(xué),神經(jīng)生物學(xué)等學(xué)科都有著非常廣泛的應(yīng)用。因此針對(duì)現(xiàn)有的蛋白純化體系中使用的標(biāo)簽無(wú)法實(shí)時(shí)指示目標(biāo)蛋白在（大腸桿菌菌株中）表達(dá)、純化中的情況，蛋白純化實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，可控性差的問(wèn)題，我們由熒光蛋白的一系列良好特性得到啟發(fā)，利用新型熒光蛋白superfold Green Fluorescnt Protein (sGFP) 構(gòu)建保有傳統(tǒng)標(biāo)簽優(yōu)點(diǎn)的可視化的生物反應(yīng)器，打開(kāi)蛋白工程的“暗箱”，將所構(gòu)建的具有優(yōu)良特性的蛋白純化體系用于生命科學(xué)相關(guān)研究和應(yīng)用。 另外，在目前的生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，存在著如實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)趣味性不高、實(shí)驗(yàn)操作流程不明確等問(wèn)題，因此降低了生物實(shí)驗(yàn)對(duì)幫助學(xué)生加深理論基礎(chǔ)認(rèn)識(shí)的作用有限，同時(shí)由于本身趣味性、科普性不強(qiáng)，不能使現(xiàn)代蛋白質(zhì)表達(dá)純化技術(shù)被專業(yè)外的學(xué)生了解和知曉。隨著我們構(gòu)建的該系統(tǒng)的逐步完善，發(fā)現(xiàn)通過(guò)熒光蛋白進(jìn)行可視化監(jiān)控的蛋白表達(dá)純化系統(tǒng)能在某些程度上解決如上的一些問(wèn)題。經(jīng)過(guò)相關(guān)的了解，我們的系統(tǒng)可以在生化實(shí)驗(yàn)、基因工程實(shí)驗(yàn)等教學(xué)使用中，通過(guò)全程的可視化示蹤降低實(shí)驗(yàn)的難度，提高學(xué)生興趣，能讓同學(xué)們較快理解蛋白表達(dá)純化的全過(guò)程及其原理。
作品圖片
作品專業(yè)信息
設(shè)計(jì)、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點(diǎn)、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)
- 一、設(shè)計(jì)發(fā)明目的和基本思路： 針對(duì)現(xiàn)有的蛋白純化體系中使用的標(biāo)簽無(wú)法實(shí)時(shí)指示目標(biāo)蛋白在表達(dá)、純化中的情況，同時(shí)為了避免蛋白純化實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，可控性差的問(wèn)題，我們由熒光蛋白的一系列良好特性得到啟發(fā)，利用新型超級(jí)折疊綠色熒光蛋白熒光蛋白構(gòu)建保有傳統(tǒng)接頭優(yōu)點(diǎn)的可視化的生物反應(yīng)器，將所構(gòu)建的具有優(yōu)良特性的蛋白純化體系用于生命科學(xué)相關(guān)研究和應(yīng)用。而在教學(xué)應(yīng)用方面，我們的系統(tǒng)也可應(yīng)用在生化、基因工程等教學(xué)使用中，通過(guò)全程的可視化示蹤降低實(shí)驗(yàn)的難度，提高實(shí)驗(yàn)趣味性，能讓同學(xué)們較快理解蛋白表達(dá)純化的全過(guò)程及其原理。 二、創(chuàng)新點(diǎn)（具體參見(jiàn)下表“科學(xué)性先進(jìn)性”）： 對(duì)于基因工程重組蛋白的表達(dá)、分離和純化的“黑箱操作”問(wèn)題，本作品提出了一種很好的解決辦法，使得融合蛋白的表達(dá)、純化進(jìn)程變得可視可控，實(shí)驗(yàn)者可迅速作出判斷而無(wú)需依賴SDS-PAGE等一系列非常耗時(shí)的后續(xù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)；而本作品中使用的熒光蛋白標(biāo)簽 + 目的蛋白 + 多聚組氨酸標(biāo)簽的雙指示“夾心法”表達(dá)純化體系使融合蛋白的表達(dá)過(guò)程直觀顯現(xiàn)，同時(shí)顯著增加表達(dá)產(chǎn)量，使得整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程速度加快，成功率也大大提高。 三、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)： 利用本系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)原核表達(dá)和純化，在蛋白質(zhì)產(chǎn)量、純度、生物活性、實(shí)驗(yàn)操作難易度、實(shí)驗(yàn)過(guò)程的可視可控性、實(shí)驗(yàn)成本等方面與傳統(tǒng)標(biāo)簽的蛋白質(zhì)表達(dá)純化系統(tǒng)進(jìn)行綜合比較，各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于傳統(tǒng)標(biāo)簽的蛋白表達(dá)、純化系統(tǒng)。
科學(xué)性、先進(jìn)性
- 1.過(guò)程可視可控。首次嘗試將熒光蛋白作為增溶接頭使用并成功應(yīng)用，在保持傳統(tǒng)增溶接頭優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)利用熒光蛋白良好的非外源因子依賴發(fā)光特性使實(shí)驗(yàn)的過(guò)程變得可視可控，提前知道蛋白表達(dá)的情況怎么樣，是否斷裂表達(dá)嚴(yán)重，從柱上分步洗脫的時(shí)候在哪幾管里，我們不僅能提高我們的實(shí)驗(yàn)效率，加速我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，還能從經(jīng)濟(jì)上節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。 2.綜合性能優(yōu)異。相比其他種類的熒光蛋白，07年報(bào)道的新型熒光蛋白sGFP的溶解性很好，穩(wěn)定程度更高，并且能幫助融合表達(dá)的目標(biāo)蛋白正確折疊，進(jìn)一步提高了融合蛋白的溶解度和活性，使得我們構(gòu)建的蛋白純化體系不僅在增溶效果、蛋白活性高低等各項(xiàng)性能不輸傳統(tǒng)的蛋白純化體系，而且擁有了可視的特性。 3.雙接頭指示，純化過(guò)程更直觀。將sGFP于目標(biāo)蛋白N端，His接頭于C端在大腸桿菌Rossetta表達(dá)菌株中融合表達(dá)，再將菌液上清通過(guò)鎳柱富集蛋白。由于只有全長(zhǎng)表達(dá)的融合蛋白才能結(jié)合到鎳柱上的同時(shí)發(fā)射熒光，因此全長(zhǎng)表達(dá)的融合蛋白量的多少可以通過(guò)目測(cè)直接判斷，在后續(xù)純化實(shí)驗(yàn)中也方便跟蹤。
獲獎(jiǎng)情況及鑒定結(jié)果
- 一、2009年5月中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)副理事長(zhǎng)余龍教授出具推薦信一封。 二、2009年5月國(guó)家教育部生物科學(xué)與工程教學(xué)指導(dǎo)委員會(huì)副主任、生物科學(xué)專業(yè)分委員會(huì)主任、復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院原教學(xué)副院長(zhǎng)喬守怡教授對(duì)本項(xiàng)目給予了極高評(píng)價(jià)，并出具了本項(xiàng)目適合在教學(xué)中推廣的應(yīng)用證明。
作品所處階段
- 中試階段
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
- 無(wú)
作品可展示的形式
- 實(shí)物、產(chǎn)品,現(xiàn)場(chǎng)演示,錄像
使用說(shuō)明,技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì),適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說(shuō)明,市場(chǎng)分析,經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測(cè)
- 一、技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì) 熒光蛋白標(biāo)簽亮度高，穩(wěn)定，可視化，性質(zhì)穩(wěn)定，助折疊，提高目的蛋白溶解性等特點(diǎn)；雙標(biāo)簽“夾心法”設(shè)計(jì)指示蛋白的斷裂表達(dá)情況；His標(biāo)簽長(zhǎng)度根據(jù)純化條件可任意調(diào)整；便于目的蛋白替換，操作便捷；實(shí)時(shí)監(jiān)控，節(jié)省時(shí)間和經(jīng)費(fèi)；可規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化，成批操作，帶來(lái)可觀經(jīng)濟(jì)效益。 二、適用范圍 廣泛適用于重組蛋白的表達(dá)，分離和純化，可以用于生物醫(yī)藥，工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究等多方面，還可以用于蛋白表達(dá)純化、基因工程等教學(xué)實(shí)驗(yàn)。 三、市場(chǎng)分析和經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測(cè) 能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控蛋白的表達(dá)情況，碰到問(wèn)題可于第一時(shí)間中止實(shí)驗(yàn)，以減少不必要的時(shí)間延誤和經(jīng)費(fèi)損失。對(duì)商業(yè)生產(chǎn)中一些難以表達(dá)的蛋白具有一定的幫助。純化時(shí)能夠?qū)崟r(shí)跟蹤目的蛋白走向，對(duì)操作人員不需要高的技術(shù)背景及水平要求，重復(fù)性和穩(wěn)定性能進(jìn)一步保證產(chǎn)業(yè)化的實(shí)現(xiàn)。設(shè)計(jì)有多核苷酸酶切位點(diǎn)，方便目的蛋白的替換，操作簡(jiǎn)易，廣泛應(yīng)用性強(qiáng)，利于拓展?jié)撛谑袌?chǎng)。
同類課題研究水平概述
- 隨著蛋白質(zhì)-組學(xué)研究的深入，將待研究蛋白與增溶標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)和純化已經(jīng)成為常規(guī)手段。而由于熒光蛋白相關(guān)的研究開(kāi)展不久，尤其是新型熒光蛋白sGFP的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用在最近一兩年才開(kāi)始，因此我們與國(guó)際領(lǐng)先水平站在同一起跑線上。 目前國(guó)際上對(duì)目的蛋白前后接多個(gè)Tag的很多，如His, MBP, GST等，但是具體應(yīng)用至商業(yè)化生產(chǎn)上的的不算多，而國(guó)內(nèi)用多標(biāo)簽進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)幾乎沒(méi)有。將新型熒光蛋白sGFP和His作為雙標(biāo)簽、“夾心法”運(yùn)用于蛋白商業(yè)生產(chǎn)則未見(jiàn)報(bào)道。 熒光蛋白目前被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予在熒光蛋白上有突出貢獻(xiàn)的三位科學(xué)家后，熒光蛋白成為了生物大分子中的“明星分子”。但是熒光蛋白的應(yīng)用多在理論研究上面，無(wú)論在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)上還不多。新型熒光蛋白sGFP的應(yīng)用更是剛剛起步，我們將在發(fā)展已有研究基礎(chǔ)的技術(shù)平臺(tái)的基礎(chǔ)上，力爭(zhēng)在多方面有所創(chuàng)新。
