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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 新型微生物溶栓酶的開(kāi)發(fā)
- 來(lái)源：
- 第十一屆“挑戰(zhàn)杯”國(guó)賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 為了獲得良好的第三代新型微生物溶栓藥物，本實(shí)驗(yàn)篩選得到一株高產(chǎn)溶栓酶菌株，獲得該酶的詳細(xì)生理生化性質(zhì)。擴(kuò)增出豆豉溶栓酶基因并進(jìn)行了原核表達(dá)，利用生物信息學(xué)分析該酶的詳細(xì)信息，并通過(guò)體外分子進(jìn)化技術(shù)對(duì)酶的編碼基因進(jìn)行進(jìn)化改造。通過(guò)體外對(duì)人血相關(guān)實(shí)驗(yàn)了解該酶的溶血栓效果和毒副作用。
- 詳細(xì)介紹：
- 在收集的豆豉產(chǎn)品中分離到369株革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)溶栓酶活性篩選，得到一株高產(chǎn)溶栓酶菌株，對(duì)該菌株進(jìn)行形態(tài)、生理、生化鑒定，初步鑒定為枯草芽孢桿菌。通過(guò)分離純化得到了純度較高的溶栓酶。 獲得該酶的一些生理生化信息，確定該酶作用的最適溫度、酶作用的最適pH、酶的熱穩(wěn)定性、酶的pH穩(wěn)定性、金屬離子對(duì)酶活性的影響等。 利用PCR方法從該菌株的總DNA中擴(kuò)增出豆豉溶栓酶成熟肽編碼區(qū)片段。將DFE的編碼基因克隆到表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，從而構(gòu)建了pET32a-dfe重組質(zhì)粒。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)大量蛋白，經(jīng)親和純化得到較純的重組溶栓酶蛋白。 通過(guò)生物信息學(xué)分析表明，該酶的基因序列與已發(fā)表的酶具有很高的同源性，編碼381個(gè)氨基酸，具有信號(hào)肽，并且具有典型的溶酶保守區(qū)域。利用軟件、數(shù)據(jù)庫(kù)等工具進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明該酶的等電點(diǎn)為6.325，分子量為27727.802 Da,是a螺旋，β折疊和無(wú)規(guī)卷曲共同構(gòu)成的混和型蛋白，是一個(gè)緊密的球狀蛋白。在線分析發(fā)現(xiàn)存在信號(hào)肽,表明其為分泌蛋白，其段裂位點(diǎn)很可能在21或22個(gè)氨基酸之間。 為了提高重組溶栓酶的活力，本試驗(yàn)通過(guò)易錯(cuò)PCR和交錯(cuò)延伸技術(shù)對(duì)豆豉溶栓酶的編碼基因進(jìn)行改造。并將得到的突變基因連接到pET-28a(+)載體上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌中，對(duì)得到的重組菌進(jìn)行兩步篩選。得到了酶活較出發(fā)菌株酶活高的重組菌。 本文還以人血為材料，對(duì)酶液進(jìn)行體外溶血栓實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該酶具有溶血栓效果，對(duì)紅細(xì)胞無(wú)無(wú)毒副作用。是一種良好的潛在溶血栓藥物。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：獲得好的第三代溶血栓酶制劑。 基本思路：篩選一株高產(chǎn)溶栓酶菌株，弄清該酶的理化性質(zhì)，克隆表達(dá)該酶，生物信息學(xué)分析該酶，體外分子進(jìn)化技術(shù)改造該酶，體外實(shí)驗(yàn)該酶的溶血栓效果和毒副作用。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 1)該菌株產(chǎn)酶量是目前同類報(bào)道中很高的。 2)獲得了高純度的溶栓酶。 3)實(shí)現(xiàn)了該酶的高效表達(dá)。 4)利用生物信息學(xué)全面分析了該酶的一些特征。 5)應(yīng)用體外分子進(jìn)化技術(shù)，定向選擇到的突變酶與底物的親和力得到提高，催化能力也明顯提高。 6)較詳細(xì)地實(shí)驗(yàn)了該酶的體外溶栓效果，溶栓酶體外對(duì)人血有明顯的抗栓、溶栓作用，而無(wú)副作用。具有很好的應(yīng)用潛力。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 目前，我國(guó)近2億人患有心血管疾病，現(xiàn)用的溶栓劑存在毒副作用大、在體內(nèi)半衰期較短、來(lái)源緊缺等缺點(diǎn)，而微生物溶栓酶安全無(wú)毒、制備原料豐富，價(jià)格低廉，直接高效地溶解纖維蛋白，還可通過(guò)消化道直接吸收。 該溶栓酶有明顯的抗栓、溶栓作用，且對(duì)人的紅細(xì)胞不產(chǎn)生副作用。因此，豆豉溶栓酶作為良好溶栓劑，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 分離到一株高產(chǎn)溶栓酶菌株。分離純化得到了純度較高的溶栓酶，并對(duì)該溶栓酶的性質(zhì)進(jìn)行研究。 利用PCR方法從該菌株的總DNA中擴(kuò)增出豆豉溶栓酶成熟肽編碼區(qū)片段。將DFE的編碼基因克隆到表達(dá)載體pET32a(+)中并轉(zhuǎn)化到E. coli BL21 (DE3)中，從而構(gòu)建了重組質(zhì)粒。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)大量蛋白，經(jīng)親和純化得到較純的重組溶栓酶蛋白。 通過(guò)生物信息學(xué)分析表明，該酶編碼381個(gè)氨基酸，具有典型的溶酶保守區(qū)域。等電點(diǎn)為6.325，分子量為27727.802 Da,是a螺旋，β折疊和無(wú)規(guī)卷曲共同構(gòu)成的混和型球狀蛋白。該酶存在信號(hào)肽,表明其為分泌蛋白。 為了提高重組溶栓酶的活力，本試驗(yàn)通過(guò)易錯(cuò)PCR和交錯(cuò)延伸技術(shù)對(duì)豆豉溶栓酶的編碼基因進(jìn)行改造。并將得到的突變基因連接到pET-28a(+)載體上，再轉(zhuǎn)化到宿主菌中，對(duì)得到的重組菌進(jìn)行兩步篩選。得到了與底物親和力提高、催化活力提高的突變株。 本文還以人血為材料，對(duì)酶液進(jìn)行體外溶血栓實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，溶栓酶體外對(duì)人血有明顯的抗栓、溶栓作用，且對(duì)人的紅細(xì)胞不產(chǎn)生副作用，顯示出良好的應(yīng)用前景。
獲獎(jiǎng)情況
- 本作品2007年于本校獲得“校大學(xué)生課外學(xué)術(shù)作品一等獎(jiǎng)”。
鑒定結(jié)果
- 情況屬實(shí)。
參考文獻(xiàn)
- 1）梅樂(lè)和，等．納豆枯草桿菌的篩選和納豆激酶發(fā)酵條件優(yōu)化．浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（工學(xué)版），2004，38(10)：1355~1360。 2）Zhang RH, et al. Gene expression and characteristics of a novel fibrinolytic enzyme (subtilisin DFE) in Escherichia coli. Microbiology, 2005, 41: 190-195. 3）Peng Y, et al．Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4 screened from douchi, a traditional Chinese soybean food．Comparative Biochemistry and Physiology Part B，2003,134: 45~52.
同類課題研究水平概述
- 目前，從豆豉中篩選出的產(chǎn)豆豉溶栓酶的菌株分別有枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌。閻家麒等從自制豆豉中篩選出一株在發(fā)酵產(chǎn)物中產(chǎn)生高纖溶活性蛋白酶的枯草芽孢桿菌。董明盛等人從豆豉中分離到產(chǎn)溶栓酶高活力菌株，菌種鑒定為枯草芽孢桿菌，并對(duì)其產(chǎn)酶的特性進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究。1996年韓國(guó)的Kim等也從韓國(guó)傳統(tǒng)食品豆醬中分離到產(chǎn)纖溶活性的蛋白酶。1999年我國(guó)的李江偉等從豆豉中分離純化到一種具有較強(qiáng)纖溶活性的酶。韓潤(rùn)林等也從豆豉中分離到一株枯草桿菌，具有較高的溶栓酶活性，精制后比活達(dá)到了9800 U/mg，活性回收率為63.8%。四川大學(xué)的彭勇等從豆豉中篩選到解淀粉芽孢桿菌DC-4，所產(chǎn)生的溶栓酶能高效地溶解體外血栓，發(fā)酵液酶活達(dá)820U/mL。 隨著這幾年對(duì)溶栓酶的大量研究，我們已經(jīng)對(duì)該酶的分子量、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性、作用底物有了進(jìn)一步的了解。閻家麒對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了研究。運(yùn)用SDS-PAGE 凝膠電泳測(cè)得豆豉纖溶酶的分子量為31 kDa，為一種單鏈多肽酶。李江偉等采用SDS-PAGE電泳方法初步測(cè)定純化的豆豉纖溶酶的分子量為36 kDa。韓潤(rùn)林等分離得到的溶栓酶的分子量有20、27、28、30 kDa 等多種。 閻家麒還對(duì)纖溶酶的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，豆豉纖溶酶在40℃以下穩(wěn)定性良好，50℃，1 h 嚴(yán)重失活，60℃活性全部喪失。酶溶液于-18℃反復(fù)凍融5次，活性仍保存95%以上。該酶在pH 7-11 范圍內(nèi)穩(wěn)定，而在pH值低于5時(shí)，很快失活。 用5種合成的小分子作底物來(lái)做試驗(yàn)表明，豆豉纖溶酶有其特異的蛋白水解作用和識(shí)別位點(diǎn)。李江偉在對(duì)人血凝塊的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用豆豉溶栓酶、尿激酶和生理鹽水比較，同等條件下，豆豉溶栓酶血塊溶解率2 h大于50%，6 h后溶解率為100%，尿激酶對(duì)血塊溶解率分別是45%和75%。王金英對(duì)豆豉溶栓酶作用進(jìn)行研究，結(jié)果是，劑量為150-300 mg/kg時(shí)，具有抑制家兔動(dòng)脈血栓形成及溶解提取液能明顯減少家兔動(dòng)脈血栓重量，溶解動(dòng)脈血栓；而小劑量提取液可預(yù)防血栓形成。 本研究得到的菌株可以高產(chǎn)溶血栓酶，該酶具有很好的溶血栓作業(yè)，并無(wú)毒副作業(yè)，顯示出很好的應(yīng)用前景。
