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基本信息
- 項(xiàng)目名稱(chēng)：
- 利用GST融合多肽制備人源膜受體多抗的研究
- 來(lái)源：
- 第十一屆“挑戰(zhàn)杯”國(guó)賽作品
- 小類(lèi)：
- 生命科學(xué)
- 大類(lèi)：
- 自然科學(xué)類(lèi)學(xué)術(shù)論文
- 簡(jiǎn)介：
- 疾病的產(chǎn)生大多是由于膜受體蛋白發(fā)生異常所引起的，抗體檢測(cè)疾病是目前醫(yī)學(xué)上常用的檢測(cè)方法。 免疫血清學(xué)診斷方法具有多指標(biāo)、大樣本和高度自動(dòng)化等眾多優(yōu)點(diǎn)，但是各種檢測(cè)方法的基本原理仍然依賴(lài)于抗原抗體間的特異性結(jié)合，建立一種能夠持續(xù)產(chǎn)生具有一定特異性的抗體制備方法是發(fā)展免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本條件之一，產(chǎn)生的抗體可以檢測(cè)膜上受體的含量，從而為疾病的檢測(cè)提供一定的依據(jù)。 本項(xiàng)目采用基因重組的方式，通過(guò)載體與目的基因融合，表達(dá)出具有GST標(biāo)簽的多肽，進(jìn)而免疫產(chǎn)生具有高效價(jià)和特異性的多克隆抗體，從核苷酸層面上進(jìn)行膜受體抗體的制備。
- 詳細(xì)介紹：
- 受體是細(xì)胞表面或亞細(xì)胞組分中的一種分子，通常位于細(xì)胞膜上，主要為膜蛋白，可以識(shí)別有生物活性的化學(xué)信號(hào)物質(zhì)（配體），并與其發(fā)生特異性結(jié)合，從而激活或啟動(dòng)一系列生物化學(xué)反應(yīng)，最后導(dǎo)致該信號(hào)物質(zhì)特定的生物效應(yīng)。疾病的產(chǎn)生大多是由于膜受體蛋白發(fā)生異常所引起的，抗體檢測(cè)疾病是目前醫(yī)學(xué)上常用的檢測(cè)方法。 免疫血清學(xué)診斷方法具有多指標(biāo)、大樣本和高度自動(dòng)化等眾多優(yōu)點(diǎn)，但是各種檢測(cè)方法的基本原理仍然依賴(lài)于抗原抗體間的特異性結(jié)合，建立一種能夠持續(xù)產(chǎn)生具有一定特異性的抗體制備方法是發(fā)展免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本條件之一，產(chǎn)生的抗體可以檢測(cè)膜上受體的含量，從而為疾病的檢測(cè)提供一定的依據(jù)。 全長(zhǎng)的膜蛋白很難進(jìn)行基因工程方法獲得，雖然其表面抗原決定簇可以通過(guò)基因克隆的方法獲得，不過(guò)短肽的免疫原性較低，甚至沒(méi)有免疫原性，本項(xiàng)目采用基因重組的方式，通過(guò)載體與目的基因融合，表達(dá)出具有GST標(biāo)簽的多肽，進(jìn)而免疫產(chǎn)生具有高效價(jià)和特異性的多克隆抗體，從核苷酸層面上進(jìn)行膜受體抗體的制備。
作品專(zhuān)業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 全長(zhǎng)的膜蛋白很難進(jìn)行基因工程方法獲得，雖然其表面抗原決定簇可以通過(guò)基因克隆的方法獲得，不過(guò)短肽的免疫原性較低，甚至沒(méi)有免疫原性，但用GST融合多肽能夠使其具有免疫原性，可免疫動(dòng)物產(chǎn)生相應(yīng)抗體，同時(shí)解決了膜蛋白抗體制備困難的問(wèn)題，此多克隆抗體可以檢測(cè)膜上受體的含量，從而為疾病的檢測(cè)提供一種新的方法。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 抗體檢測(cè)疾病是目前醫(yī)學(xué)上常用的檢測(cè)方法，單抗檢測(cè)費(fèi)用昂貴，多抗檢測(cè)成本低，傳統(tǒng)的多抗制備方法分為全蛋白免疫和載體蛋白與多肽耦合，但其產(chǎn)生的抗體多且雜、不易純化、費(fèi)用昂貴、操作具有一定危險(xiǎn)性。膜受體的表達(dá)具有一定困難性，其抗體也不易制備，本項(xiàng)目采用基因重組的方式，通過(guò)載體與目的基因融合，表達(dá)出具有GST標(biāo)簽的多肽，進(jìn)而免疫產(chǎn)生具有高效價(jià)和特異性的多克隆抗體，從核苷酸層面上進(jìn)行膜受體抗體的制備。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 一代代多抗檢測(cè)試劑盒的推出，為病人帶來(lái)了新的生命之光。多抗還可以用于基因功能研究、蛋白細(xì)胞定位、RNAi 干擾、miRNA 功能研究、反向蛋白質(zhì)組學(xué)等。市場(chǎng)上常用的單抗檢測(cè)試劑盒售價(jià)昂貴，為多抗檢測(cè)試劑盒的10倍左右，而現(xiàn)有的多抗檢測(cè)試劑盒售價(jià)一般為＄229/200μL，價(jià)格同樣較昂貴，本項(xiàng)目所制備的高特異性多抗將主要應(yīng)用于檢測(cè)膜蛋白，為疾病的檢測(cè)提供一定依據(jù)，且所需成本較低，具有較高性?xún)r(jià)比。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 受體是細(xì)胞表面或亞細(xì)胞組分中的一種分子，通常位于細(xì)胞膜上，主要為膜蛋白，可以識(shí)別配體，并與其發(fā)生特異性結(jié)合，從而引發(fā)一系列生物效應(yīng)。我們首先選取與疾病相關(guān)的膜受體蛋白作為研究對(duì)象，將其氨基酸殘基序列用BJTEpitope軟件預(yù)測(cè)抗原決定簇，選取這些抗原決定簇中親水性最強(qiáng)的構(gòu)建融合多肽，人工合成編碼該決定簇TnCAb的DNA片段，該片段長(zhǎng)為51 bp，編碼16個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子量為4 kD。接著將該片段克隆到表達(dá)載體pGEX-4T-3的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，得到了融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3-TnCAb，經(jīng)PCR及測(cè)序證明重組子是正確的。將該重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-star，用終濃度為1 mM的IPTG誘導(dǎo)重組菌，收集菌體裂解后進(jìn)行SDS-PAGE分析，在30 kD左右的位置有一特異性蛋白條帶，與預(yù)期值相符，融合蛋白以可溶的形式存在，故用超聲裂解菌體后12000 rpm離心所得的上清以親和層析的方法純化目的蛋白GST-tag TnCAb。以純化所得蛋白為抗原免疫雄性新西蘭兔，制備了該重組蛋白的多克隆抗體，ELISA檢測(cè)該抗血清效價(jià)，Western blot檢測(cè)抗體特異性。
獲獎(jiǎng)情況
- 獲2008年省級(jí)相關(guān)學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)項(xiàng)目資助 論文“抗體制備技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用”已錄用在“藥物生物技術(shù)”雜志上 論文“甲型H1N1流感的流行現(xiàn)狀及處理對(duì)策的思考”已錄用在“藥物生物技術(shù)”雜志上 論文“利用GST融合多肽制備人源膜受體多抗的研究”已錄用在××大學(xué)學(xué)報(bào)上
鑒定結(jié)果
- 我們成功地完成了多肽的GST融合表達(dá)并利用GST融合多肽制備了多克隆抗體，該多抗與免疫原具有一定的特異性，可以進(jìn)一步研究各種膜蛋白抗原表位多肽的抗體制備及其抗體效價(jià)、特異性的分析。
參考文獻(xiàn)
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同類(lèi)課題研究水平概述
- 免疫血清學(xué)診斷方法也由單純的免疫凝集、免疫沉淀、免疫擴(kuò)散技術(shù)發(fā)展為結(jié)合不同標(biāo)記物（如放射性同位素、熒光物質(zhì)、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等）的免疫標(biāo)記技術(shù)，檢測(cè)過(guò)程和數(shù)據(jù)讀取也逐步向半自動(dòng)化和自動(dòng)化過(guò)渡。 常用的多克隆抗體制備的方法有兩種：全蛋白免疫產(chǎn)抗體和蛋白與多肽耦合免疫產(chǎn)抗體。全蛋白法免疫產(chǎn)生的抗體多且雜，不易純化，檢測(cè)效果不佳，蛋白與多肽耦合刺激產(chǎn)抗體法為生物公司常用方法，但所需試劑價(jià)格昂貴且具一定危險(xiǎn)性，如制備時(shí)所需的試劑戊二醛有很大毒性，目前常用的載體蛋白為BSA或血藍(lán)蛋白。 全長(zhǎng)的膜蛋白很難進(jìn)行基因工程方法獲得，短肽免疫原性低，甚至不具有免疫原性。本項(xiàng)目致力于研究一種人源膜受體多抗的制備方法，通過(guò)載體與目的基因重組，表達(dá)出具有GST標(biāo)簽的多肽，進(jìn)而免疫產(chǎn)生具有高效價(jià)和特異性的多克隆抗體，從核苷酸層面上進(jìn)行抗體的制備，產(chǎn)生的抗體可以檢測(cè)膜上受體的含量，從而為疾病的檢測(cè)提供一種新的方法。 近年來(lái)，Immunosystems Inc.已生產(chǎn)出了幾種ELISA試劑盒，其靶分析物包括殺蟲(chóng)劑、殺菌劑和除草劑。這種試劑盒配上便攜式分光光度計(jì)可實(shí)現(xiàn)野外定量快速測(cè)定，檢測(cè)靈敏度為0.03～25 ppb。隨著ELISA在農(nóng)藥監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，一些新方法也不斷涌現(xiàn)。Hall等用EIA法檢測(cè)了水樣中的污染物2,4-D,三嗪，Merolachlor并將其與氣相色譜分析結(jié)果進(jìn)行比較。Roda 等利用EIA對(duì)環(huán)境水樣中苯并芘進(jìn)行了測(cè)定。Hong利用ELISA對(duì)土壤和水中三氮雜苯類(lèi)除草劑行了測(cè)定。Hutchinson等利用ELISA檢測(cè)土壤中的EPTC。Wittmann用酶免疫分析法檢測(cè)殘留在食品中的三嗪。Weller通過(guò)改變溫育時(shí)間，提高了ELISA檢測(cè)三氮雜苯類(lèi)除草劑的靈敏度。我國(guó)的研究者也自行開(kāi)發(fā)了一些ELISA法。劉長(zhǎng)武應(yīng)用ELISA對(duì)梨、蘋(píng)果中的對(duì)硫磷殘留進(jìn)行了測(cè)定。余萬(wàn)俊制備了殺蟲(chóng)脒的特異性抗體，并以此抗體建立了大米中殺蟲(chóng)脒殘留的單克隆抗體ELISA檢測(cè)法。陽(yáng)傳和應(yīng)用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，研究出特異性強(qiáng)的T-2毒素的單克隆抗體，并建立了小麥T-2毒素的ELISA方法。周永新等進(jìn)行了蓖麻毒素多克隆抗體的研究。
