基本信息
- 項目名稱：
- 截短的豬戊型肝炎病毒ORF2基因克隆與重組蛋白的原核表達
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術(shù)論文
- 簡介：
- 用巢式PCR從陽性豬戊型肝炎糞便懸液中克隆了截短的豬戊型肝炎病毒ORF2基因（SORF2）片段，并將克隆基因亞克隆到原核表達載體pTO-T7上構(gòu)建表達質(zhì)粒pTO-T7-SORF2,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中以包涵體形式獲得了高效表達，Western-blot證明表達蛋白具有良好的特異性和反應原性，包涵體純化時發(fā)現(xiàn)該重組蛋白在4 mmol/L 的尿素-Tris溶液 (pH 7.2) 中的溶解度較大，有利于重組蛋白的復性，為今后開發(fā)家畜用診斷試劑預防豬戊型肝炎的流行與人畜交叉感染奠定了一定的基礎(chǔ).
- 詳細介紹：
- 從本地不同的養(yǎng)豬場收集豬新鮮糞便，用商品化的人用診斷試劑盒檢測，從HEV陽性的豬糞便中提取的 HEV RNA 為模板，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄和巢式PCR擴增后，擴增產(chǎn)物進行1.5％ 瓊脂糖凝膠電泳，從膠上可以看到一條清晰特異的DNA帶，擴增片段大小和預期擴增的730bp 接近，經(jīng)連接載體測序得到其為基因Ⅳ型。 用 NdeⅠ/EcoRⅠ將測序正確的 pMD18-T-SORF2 進行酶切，然后將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收約730 bp大小的片段，然后用 T4DNA 連接酶將回收片段連接到用 NdeI/EcoRI 酶切處理的 pTO-T7 表達載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后用卡那霉素篩選陽性克隆，提取陽性克隆質(zhì)粒進行酶切鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在陽性質(zhì)粒中大部分已經(jīng)連入了 SORF2，酶切片段的大小和克隆的 SORF2 大小一致，說明已經(jīng)成功構(gòu)建了插入 SORF2的pTO-T7 重組表達質(zhì)粒，命名為 pTO-T7- SORF2。 酶切驗證的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，卡那霉素篩選陽性克隆，當轉(zhuǎn)化子長到針尖大小時挑取單菌落，并誘導表達外源蛋白質(zhì)。誘導完成處理菌體后，進行12%的 SDS-PAGE，誘導了的重組菌株比沒有誘導的重組菌株在27KD 左右明顯多出了一條蛋白帶，而且其分子量與SORF2蛋白大小相符，而沒有誘導的重組菌株沒有這條帶的出現(xiàn)，說明重組蛋白在大腸桿菌中獲得了表達。凝膠成像系統(tǒng)分析，重組蛋白的表達量達到總蛋白的38%左右. 然后采用本研究室制備的單克隆抗體對大腸桿菌表達的重組蛋白 Western blot 檢測，結(jié)果表明，表達的重組蛋白具有良好的特異性和反應原性，沒有誘導的重組菌株沒有檢測出對應的活性條帶. 因此表達的重組蛋白具有作為免疫診斷抗原的潛在可能性. 重組蛋白大量表達后，收集菌體，采用超聲波裂解，分別收集上清和沉淀，進行 12% 的 SDS-PAGE，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白以包涵體的形式表達在沉淀中，將收集的包涵體進行洗滌純化，在 4 mol/L 的 Urea-Tris 中溶解度比較大，有利于重組蛋白的復性和蛋白的回收率。 在禽流感和豬流感在全球的爆發(fā)的今天，對人畜共患病的研究也越來越受到各國政府的重視.因此，本研究中我們從豬糞便中克隆了豬HEV ORF2序列，大腸桿菌中表達出了具有良好生物活性的重組豬HEV ORF2片斷蛋白，為開展診斷試劑與重組疫苗的研究打下了基礎(chǔ). 文章發(fā)表在中國科技論文統(tǒng)計源核心期刊，中國科技核心期刊《激光生物學報》2009年第18卷第3期上.
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 撰寫目的：本人在實驗室克隆出了截短的豬戊肝病毒ORF2基因，構(gòu)建了重組表達菌株，誘導表達蛋白,相關(guān)實驗證明該蛋白具有特異性和反應原性，為開發(fā)家畜用診斷試劑和疫苗預防豬戊肝的流行與人畜感染奠定了基礎(chǔ). 基本思路：1、SHEV RNA提??；2、SHEV ORF2 基因克??；3、表達載體構(gòu)建；4、重組蛋白小量鑒定；5、重組蛋白表達水平與生物活性檢測；6、工程菌表達；7、包涵體洗滌純化。
科學性、先進性及獨特之處
- 科學性：戊肝是危害人類健康的一種疾病，病原體能跨種間傳播，本實驗原核表達的ORF2是該病毒的中和表位基因，得到的重組蛋白為以后研究其感染途徑及診斷試劑盒和疫苗奠定了基礎(chǔ)。 先進性：運用經(jīng)典的分子生物學和基因工程的手段。 獨特之處：目前針對畜用ORF2蛋白研究較少，本人用巢式PCR從陽性的豬戊肝的糞便中擴增出了該基因；利用大腸桿菌表達得到了重組的具有特異性和反應原性的蛋白。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 作品的實際應用價值：得到的中和表位蛋白，可以用以研究病毒的感染、研究病毒傳播途徑；研發(fā)診斷試劑和畜用疫苗。 現(xiàn)實意義：為進一步研究該蛋白的特性和利用該蛋白解決其他問題奠定了堅實基礎(chǔ)；該蛋白具有反應特異性和反應原性。這為以后開發(fā)廉價的畜用診斷試劑和疫苗提供了一個研究方向，也為盡早阻斷動物HEV在動物間和人畜間的交叉?zhèn)鞑ズ皖A測HE的流行做出了一定的基礎(chǔ)性貢獻。
學術(shù)論文摘要
- 用巢式PCR從陽性豬戊型肝炎糞便懸液中克隆了截短的豬戊型肝炎病毒ORF2基因（SORF2）片段，并將克隆基因亞克隆到原核表達載體pTO-T7上構(gòu)建表達質(zhì)粒pTO-T7-SORF2,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中以包涵體形式獲得了高效表達，Western-blot證明表達蛋白具有良好的特異性和反應原性，包涵體純化時發(fā)現(xiàn)該重組蛋白在4 mmol/L 的尿素-Tris溶液 (pH 7.2) 中的溶解度較大，有利于重組蛋白的復性，為今后開發(fā)家畜用診斷試劑預防豬戊型肝炎的流行與人畜交叉感染奠定了一定的基礎(chǔ).
獲獎情況
- 文章發(fā)表在中國科技論文統(tǒng)計源核心期刊，中國科技核心期刊《激光生物學報》2009年第18卷第3期上
鑒定結(jié)果
- 本作品經(jīng)劉如石副教授鑒定系本文作者在導師指導下獨自完成，以上所填各項內(nèi)容均真實可信、符合自然科學研究要求，特此鑒定。
參考文獻
- 參考文獻（部分）： [1]王佑春 中國戊型肝炎病毒4型的流行病學、分子生物學和家畜感染研究[J]. 中華流行病學雜志, 2003 , 24 (7) :618～6221 [2]劉如石，何志強，李少偉，楊坤宇，鮮陽凌，逄淑強，張軍，李益民，夏寧邵. 重組戊型肝炎病毒衣殼蛋白工程菌的高密度培養(yǎng). 生物工程學報, 2004，03：450-455. (8) :1669～1674 [3]何志強，張軍，李少偉，林鑒，劉如石，陳毅歆，王穎彬，夏寧邵. 顆?；亟M戊型肝炎病毒衣殼蛋及其抗原性與免疫原性. 生物工程學報, 2004,0:263-268. [4] WONG D C, PURCELL R H, SREENIVASAN M A, et al. Epidemic and endemic hepatitis in India: evidence for non-A, non-B hepatitis virus aetiology. Lancet,1980;2: 876-879 [5] DAS K.,AGARWAL A., ANDREW R., et al. Role of hepatitis E and other hepatotropic virus in aetiology of sporadic acute viral hepatitis : a hospital based study from urban Delhi. Eur J Epidemiol ,2000,16(10) :937～940 [6] TAM A W, SMITH M M, GUERRA M E, et al. Hepatitis E virus (HEV): molecular cloning and sequencing of the full-length viral genome. Virology, 1991; 185: 120–131. [7] KABRANE-LAZIZI Y, MENG X J, PURCELL R H, et al. Evidence that the genomic RNA of hepatitis E Virus is capped. J Virol, 1999; 73: 8848–8850.
同類課題研究水平概述
- 戊肝是由戊肝病毒引起的糞口傳播的疾病，主要流行于發(fā)展中國家，常因飲用水源被污染導致暴發(fā)流行，散發(fā)病例呈全球分布，臨床上超過50 %的急性肝炎為HEV 所致，感染孕婦病死率高達20 %.我國是戊肝的高流行區(qū)之一，自1982發(fā)現(xiàn)戊肝病例以來至，今已報道了11次戊肝流行, 最大的一次爆發(fā)流行于1986年9月至1988年4月發(fā)生在新疆南部的和田、喀什和克孜勒蘇三地州，波及23個縣市，持續(xù)20多個月，共發(fā)病119280例，死亡近千人，孕婦平均死亡率為13.5%. 對人民的生命健康造成了嚴重危害，并引起了社會廣泛關(guān)注. 其基因為單股正鏈RNA，全長約7.2～7.5kb，全基因組編碼3個互相重疊開放讀碼框（ORFs），其中ORF2編碼660 aa的病毒衣殼蛋白，其上有重要的中和表位，可能與細胞受體結(jié)合，是疫苗和診斷試劑的重要組成部分. 更為主要的是，Balayon、Meng和我國病毒學家夏寧邵、王佑春等評估了家畜HEV與人HEV的交叉感染，證明HEV為人畜共患病. 接著Huang等和我國病毒學家王佑春、畢勝利、田克恭等發(fā)現(xiàn)各型間基因與氨基酸同源性很高，為HEV為人畜共患病提供了分子證據(jù). HEV在動物和人之間的交叉感染引起了一個重要的全球性的公共衛(wèi)生問題——高風險人群(獸醫(yī)、肉加工者、養(yǎng)殖戶等)能感染人畜共患性HEV，因此，HE作為一種人畜共患病也受到了應有的重視.人用診斷試劑和疫苗取得了較大的進展，我國病毒學家夏寧邵、畢勝利等研究過人HEV ORF2的重組表達作為疫苗的研究，獲得了一些具有優(yōu)良免疫源性和抗原性的重組蛋白.夏寧邵教授在大腸桿菌中表達了人HEV ORF2 aa368～606 片段,獲得的重組蛋白HEV 239可以形成病毒樣顆粒，免疫恒河猴可產(chǎn)生良好的保護性.但是到目前為止，家畜用診斷試劑和疫苗沒有取得突破性進展，而是人用疫苗和診斷試劑成本高，如果用于家畜，會增加肉與肉制品的價格，進而影響人們的生活水平. 因此研究有效的家畜專用診斷試劑和預防性疫苗來阻止家畜HEV向易感人群的傳播，越來越收到人們的重視. 尤其是禽流感和豬流感在全球的爆發(fā)，對人畜共患病的研究也越來越受到各國政府的重視.因此，本研究中我們從豬糞便中克隆了豬HEV ORF2序列，大腸桿菌中表達出了具有良好生物活性的重組豬HEV ORF2片斷蛋白，為開展診斷試劑與重組疫苗的研究打下了基礎(chǔ).
