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基本信息

項(xiàng)目名稱:
rhFGF-1ser98,132的定點(diǎn)化學(xué)修飾及修飾產(chǎn)物活性和穩(wěn)定性研究
小類:
生命科學(xué)
簡介:
重組人成纖維細(xì)胞生長因子-1(rhFGF-1)作為一種重要的功能蛋白,長期的研究和實(shí)踐表明,其對各類創(chuàng)傷及潰瘍,尤其是大面積創(chuàng)面具有突出的促愈合作用。同時(shí),臨床實(shí)踐還表明,F(xiàn)GF-1對心肌梗死、糖尿病并發(fā)的下肢潰瘍、神經(jīng)退行性疾病等均具有重要的作用。然而,rhFGF-1存在體外穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短的缺陷日益構(gòu)成該藥產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的“技術(shù)瓶頸”。本課題采用化學(xué)修飾劑聚乙二醇(PEG)定點(diǎn)修飾突變體rhFGF-1ser98,132,可以增強(qiáng)rhFGF-1的生物穩(wěn)定性,延長體內(nèi)半衰期,降低免疫原性。為開發(fā)穩(wěn)定性更好、安全性更高的rhFGF-1新型制劑奠定基礎(chǔ)。
詳細(xì)介紹:
rhFGF-1作為一種重要的功能蛋白,其部分制劑已經(jīng)上市并產(chǎn)生了可觀的經(jīng)濟(jì)和社會效益,但該類生長因子新藥作為蛋白藥物,穩(wěn)定性差、體內(nèi)生物半衰期短也一直是臨床使用過程亟待解決的難題。課題組在前期研究工作基礎(chǔ)上提出了以聚乙二醇(PEG)為化學(xué)修飾劑對rhFGF-1進(jìn)行化學(xué)修飾,以期獲得穩(wěn)定性和安全性好的新型蛋白藥物的新思路。更為關(guān)鍵的是,課題組認(rèn)識到,長期以來,蛋白質(zhì)的定點(diǎn)修飾一直是科學(xué)研究熱點(diǎn),這是因?yàn)殡S機(jī)的化學(xué)修飾會增加后續(xù)樣品純化的復(fù)雜性。通過對hFGF-1的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其一級結(jié)構(gòu)中共含有三個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基,分別位于第31,98,132位,第98位和第132位半胱氨酸對于維持蛋白質(zhì)的活性是不必需的,因此本課題組創(chuàng)造性的采用基因工程方法用中性氨基酸如:絲氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)取代Cys,構(gòu)建了活性保存率好的突變體rhFGF-1ser98,132。通過離子交換、肝素親和兩步層析純化,獲得了促Balb/c 3T3細(xì)胞增值活性與天然hFGF-1對照品相似的rhFGF-1 ser98,132突變體純品,并用20kDPEG-馬來酸酰亞胺酯對其進(jìn)行定點(diǎn)化學(xué)修飾,修飾產(chǎn)物除保留了生長因子的促分裂活性外,在熱穩(wěn)定性、抗胰蛋白酶水解能力、動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定性方面均有明顯的改善。本課題為如何解決hFGF-1長期存在的穩(wěn)定性差、具有免疫原性等臨床缺陷提供了重要的方法;同時(shí)為改善和提高生長因子及其他蛋白藥物的生物學(xué)性能提供了有效的理論和實(shí)驗(yàn)手段,具有較為重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義;該項(xiàng)目的成功實(shí)施有望在世界上搶先獲得專利并部分地代替現(xiàn)有產(chǎn)品。

作品圖片

  • rhFGF-1ser98,132的定點(diǎn)化學(xué)修飾及修飾產(chǎn)物活性和穩(wěn)定性研究
  • rhFGF-1ser98,132的定點(diǎn)化學(xué)修飾及修飾產(chǎn)物活性和穩(wěn)定性研究
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作品專業(yè)信息

撰寫目的和基本思路

與其他蛋白類藥物一樣,rhFGF-1也存在穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短的問題,同時(shí),由于通常在構(gòu)建過程中對其序列進(jìn)行一定地改造,也使其在一定程度上存在免疫原性問題。用20kDPEG-馬來酸酰亞胺定點(diǎn)修飾rhFGF-1ser98,132,可以增強(qiáng)其生物穩(wěn)定性,延長體內(nèi)半衰期,降低免疫原性。為開發(fā)穩(wěn)定性更好、安全性更高的rhFGF-1新型制劑奠定基礎(chǔ)。

科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處

本課題屬于自主創(chuàng)新類課題。hFGF-1第98位和第132位半胱氨酸對于維持蛋白質(zhì)的活性是不必需的,因此創(chuàng)造性地采用PCR的方法獲得了rhFGF-1突變體rhFGF-1ser98,132 ,并采用20kDPEG-馬來酸酰亞胺成功實(shí)現(xiàn)了對rhFGF-1的定點(diǎn)化學(xué)修飾。通過上述修飾,獲得的修飾產(chǎn)物不僅活性保存率高而且穩(wěn)定性取得了較大地提高,有效克服了rhFGF-1蛋白穩(wěn)定性差的缺陷。

應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義

rhFGF-1可廣泛用于治療各類創(chuàng)傷、潰瘍、神經(jīng)損傷、眼科等疾病。但其穩(wěn)定性差、半衰期短的缺陷卻大大限制了其臨床應(yīng)用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)PEG修飾可以有效地提高蛋白的穩(wěn)定性、延長體內(nèi)半衰期。因此本課題擬采用PEG化學(xué)修飾擬實(shí)現(xiàn)FGF-1的高穩(wěn)定性和延長半衰期無疑具有重要的意義。相信該課題的成功實(shí)施,必將為打破制約FGF-1產(chǎn)業(yè)化推廣的關(guān)鍵技術(shù)“瓶頸”、拓展FGF-1的臨床應(yīng)用起到積極的推動(dòng)作用。

學(xué)術(shù)論文摘要

題目:rhFGF-1ser98,132的定點(diǎn)化學(xué)修飾及修飾產(chǎn)物活性和穩(wěn)定性研究 目的:用20kDPEG-馬來酸酰亞胺定點(diǎn)修飾rhFGF-1ser98,132,以增強(qiáng)其生物穩(wěn)定性,延長體內(nèi)半衰期,降低免疫原性。 方法:采用PCR法構(gòu)建了用絲氨酸取代rhFGF-1的第98,132位半胱氨酸的突變體rhFGF-1ser98,132,然后用20kDPEG-馬來酸酰亞胺對rhFGF-1突變體的第31位半胱氨酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)化學(xué)修飾。 結(jié)果:通過對修飾過程優(yōu)化,蛋白修飾產(chǎn)率能夠達(dá)到51.8%。與非修飾型rhFGF-1相比,經(jīng)PEG修飾的rhFGF-1仍保留著約52.5%的有絲分裂原活性和相似的二級結(jié)構(gòu)。此外,其熱穩(wěn)定性和抗酶解穩(wěn)定性顯著提高。 結(jié)論:經(jīng)過PEG定點(diǎn)化學(xué)修飾,rhFGF-1的熱穩(wěn)定性和抗酶解穩(wěn)定性顯著提高。 關(guān)鍵詞:聚乙二醇修飾 成纖維細(xì)胞生長因子 化學(xué)修飾 穩(wěn)定性

獲獎(jiǎng)情況

1. 英文文章已投稿于《Singapore 2009 International Conference on biotechnology and Nalotechnology 》,目前已收到邀請函; 2.論文《PEG-hFGF-1對SD大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)作用》已投稿于《中國生物工程雜志》; 3.已申請發(fā)明專利一項(xiàng):《成纖維細(xì)胞生長因子-1及其突變體的聚乙二醇修飾產(chǎn)物》,受理號:200910099031.6; 4.浙江省第十一屆“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽特等獎(jiǎng)。

鑒定結(jié)果

參考文獻(xiàn)

1.J Invest Dermatol.104,850-5. 2.Surgery.120,182-188. 3.Biochem Biophys Res Commun.171,1387-94. 4.J Biol Chem.266,5842-6. 5.Proc Natl Acad Sci USA.84,1487-91. 6.J.Biol.Chem.269,7610-6. 7.Growth Factors.3,287-98.

同類課題研究水平概述

蛋白質(zhì)化學(xué)修飾技術(shù)是近年來快速發(fā)展的新興技術(shù)。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾是指通過以某些物質(zhì)如PEG、葡聚糖、肝素等作為化學(xué)修飾劑與蛋白質(zhì)的活性基團(tuán)發(fā)生反應(yīng),從而達(dá)到改善蛋白質(zhì)性質(zhì),如解除異體蛋白質(zhì)免疫原性、毒副作用以及增加活性、提高穩(wěn)定性、延長體內(nèi)半衰期的目的。 在蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾中,修飾劑的選擇非常重要。一般條件下,要求修飾劑具有較大的分子量,良好的生物相容性及水溶性,修飾劑分子表面有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)等,歸因于PEG類修飾劑的卓越特性,目前應(yīng)用最為廣泛?;瘜W(xué)修飾的另一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)即選擇合適的修飾位點(diǎn),以前對于蛋白質(zhì)或肽類分子,常常參與反應(yīng)的修飾基團(tuán)為α-氨基和ε-氨基,但針對該類基團(tuán)的化學(xué)修飾,隨機(jī)性和偶然性比較大,對分離制備帶來了很大的困難,目前針對特異位點(diǎn)的定點(diǎn)修飾成為研究熱點(diǎn),其中主流的方法有:① 通過定點(diǎn)突變的方法,引入游離的半胱氨酸殘基,采用合適的修飾劑對該突變體實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)修飾;② 通過設(shè)計(jì)特定的化學(xué)修飾制劑與蛋白質(zhì)中特定的糖類殘基或-0H發(fā)生特異性的偶聯(lián)反應(yīng),實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)修飾。 到目前為止,國內(nèi)外PEG修飾技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于近100種不同酶類、蛋白、多肽和其它化合物。PEG修飾蛋白質(zhì)藥物己廣泛應(yīng)用于臨床。但在這方面,國外由于起步較早,已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)領(lǐng)先于我國,到目前為止,國外已有超過10種PEG修飾蛋白上市,如:干擾素α-2b、干擾素α-2α、粒細(xì)胞集落刺激因子、生長抑制素、水凝膠和天冬酰胺酶等,并且最近五年平均每年都有一個(gè)該類新藥上市;我們國家雖然有部分科研院和高校如中國藥科大學(xué)、天津大學(xué)、中國科學(xué)院、上海生化所開展相關(guān)的研究,但相比國外而言,起步晚,而且僅限于實(shí)驗(yàn)室階段,差距非常明顯,這無疑對我們提出了非常嚴(yán)峻的考驗(yàn)。 本課題為實(shí)現(xiàn)對成纖維細(xì)胞生長因子-1(FGF-1)的定點(diǎn)化學(xué)修飾,創(chuàng)造性地采用基因工程方法獲得了FGF-1突變體FGF-1ser98,132并采用PEG-馬來酰亞胺實(shí)現(xiàn)了對FGF-1的定點(diǎn)化學(xué)修飾,在國內(nèi)外均屬獨(dú)創(chuàng)性研究。本研究通過正交試驗(yàn)獲得了FGF-1的最佳修飾條件,在最佳修飾條件下,修飾產(chǎn)率達(dá)到51.8%,顯著高于國內(nèi)有關(guān)其他蛋白如IFN、GSF的化學(xué)修飾的報(bào)道;同時(shí)修飾產(chǎn)物在很好地保留蛋白活性的基礎(chǔ)上,表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性和抵抗胰蛋白酶降解的能力,該研究與國內(nèi)外研究相比具有較強(qiáng)的創(chuàng)新性,并具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
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