基本信息
- 項目名稱：
- 重組人血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子rhVEGI-192A的制備新工藝研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 惡性腫瘤已超過心血管疾病成為人類健康的頭號殺手。目前我國癌癥患者人數(shù)還在不斷地增加，惡性腫瘤已經(jīng)對人類生存、社會經(jīng)濟造成了重大的威脅。傳統(tǒng)化學(xué)藥物、放射、手術(shù)等手段雖然有一定的治療效果，但由于其高毒性、耐藥性以及清除腫瘤的不徹底性，大多數(shù)惡性腫瘤的預(yù)后如總病死率和長期生存率等在過去十年內(nèi)未出現(xiàn)明顯改進。因此，針對惡性腫瘤的有效治療，有賴于發(fā)現(xiàn)新治療靶點和針對這些靶點的新治療策略。血管內(nèi)皮生長抑制因子（VEGI）是一種新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性血管新生拮抗劑，研究發(fā)現(xiàn)，VEGI通過抑制腫瘤中的新生血管發(fā)揮抗腫瘤作用，不但能夠抑制腫瘤的生長，而且能使已經(jīng)成形的腫瘤發(fā)生潰破和萎縮，而毒副作用較少。因此，VEGI有望開發(fā)成為一種高效低毒的抗腫瘤藥物。本研究通過克隆和誘導(dǎo)表達一個重組人血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子拼接異構(gòu)體rhVEGI-192A，摸索能增加其產(chǎn)量、純度和活性的方法。通過誘導(dǎo)系統(tǒng)、宿主菌、誘導(dǎo)條件、純化復(fù)性方法的優(yōu)化，建立一個高效及穩(wěn)定生產(chǎn)可溶性好、高活性、高純度rhVEGI－192A重組蛋白的制備新工藝。并對其進行體內(nèi)以及體外抗血管新生活性研究，為其作為臨床藥物開發(fā)打下基礎(chǔ)。
- 詳細介紹：
- 血管內(nèi)皮生長抑制因子（VEGI）是一種內(nèi)源性血管新生拮抗劑，本研究通過克隆和誘導(dǎo)表達一種重組人血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子拼接異構(gòu)體（rhVEGI-192A），摸索能增加其產(chǎn)量、純度和活性的蛋白表達純化方法，并對其進行初步抗腫瘤活性研究，為其作為臨床藥物與工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。 本研究通過比較采用IPTG誘導(dǎo)和自動誘導(dǎo)兩種蛋白誘導(dǎo)體系，選用BL21 (DE3) pLysS和Origami B (DE3)兩種宿主菌，選擇不同誘導(dǎo)時間及誘導(dǎo)溫度，以摸索誘導(dǎo)蛋白高效穩(wěn)定表達最佳優(yōu)化條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用自動誘導(dǎo)蛋白表達系統(tǒng)，在OrigamiB (DE3)菌株中于25℃下誘導(dǎo)24h能很大程度提高rhVEGI-192A蛋白的產(chǎn)量和活性。采用Ni-NTA柱金屬螯合親和層析技術(shù)和梯度透析復(fù)性方法獲得了高純度、可溶性好的蛋白。采用MTT比色試驗法、Annexin V細胞染色和雞胚尿囊膜血管新生實驗分析重組蛋白的生物學(xué)活性，證明本課題系統(tǒng)性優(yōu)化制備的rhVEGI-192A蛋白具有顯著的體外抑制內(nèi)皮細胞增殖、誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡以及體內(nèi)抑制血管新生的功效。因此，本研究成功建立原核體系自動誘導(dǎo)表達人重組蛋白VEGI-192A的制備新工藝。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 血管內(nèi)皮生長抑制因子(VEGI)是一種內(nèi)源性血管新生拮抗劑，本研究通過克隆和誘導(dǎo)表達一個重組人血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子拼接異構(gòu)體rhVEGI-192A，摸索能增加其產(chǎn)量、純度和活性的方法。通過誘導(dǎo)系統(tǒng)、宿主菌、誘導(dǎo)條件、純化復(fù)性方法的優(yōu)化，建立一個高效及穩(wěn)定生產(chǎn)可溶性好、高活性、高純度rhVEGI-192A蛋白的制備新工藝。并對其進行體內(nèi)以及體外抗血管新生活性研究，為其作為臨床藥物開發(fā)打下基礎(chǔ)。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- 本課題首次將自動誘導(dǎo)技術(shù)應(yīng)用于VEGI重組蛋白的制備，成功建立一套穩(wěn)定而高效的蛋白誘導(dǎo)優(yōu)化系統(tǒng)和純化復(fù)性方法。通過該工藝可制備高純度、可溶性好、高活性的rhVEGI－192A蛋白，為臨床藥物開發(fā)打下基礎(chǔ)。且該制備工藝操作簡便，易于質(zhì)量控制，經(jīng)濟成本及人力成本低，為rhVEGI-192A的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。該項目具較強的創(chuàng)新性，科學(xué)研究意義較大，在研究成果市場化和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展前景較好，應(yīng)用價值頗高。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 本研究的對象VEGI是一種新型的血管新生抑制劑。跟目前已經(jīng)在臨床上使用的貝伐單抗的抗腫瘤原理是相似的。VEGI不僅對多種腫瘤均有抑制效果，并且毒副作用低，可長期安全使用，從而有著巨大的臨床應(yīng)用前景。本研究建立了一個高效及穩(wěn)定的自動誘導(dǎo)體系，可以為VEGI的新藥臨床試驗提供足夠量可溶性好和高活性的蛋白，而且本制備工藝操作簡便，容易控制，成本低廉。因此這項研究有望創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟和社會價值。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 血管內(nèi)皮生長抑制因子(VEGI)是一種內(nèi)源性血管新生拮抗劑，本研究通過克隆和誘導(dǎo)表達一種重組人血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子拼接異構(gòu)體(rhVEGI-192A),摸索能增加其產(chǎn)量、純度和活性的蛋白表達純化方法，并對其進行初步抗血管新生活性研究，為其作為臨床藥物與工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。本研究通過比較采用IPTG誘導(dǎo)和自動誘導(dǎo)兩種蛋白誘導(dǎo)體系，選用BL21(DE3)pLysS和OrigamiB(DE3)兩種宿主菌，選擇不同誘導(dǎo)時間及誘導(dǎo)溫度，以摸索誘導(dǎo)蛋白高效穩(wěn)定表達最佳優(yōu)化條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用自動誘導(dǎo)蛋白表達系統(tǒng)，在OrigamiB(DE3)菌株中于25℃下誘導(dǎo)24h能很大程度提高rhVEGI-192A的產(chǎn)量和活性。采用Ni-NTA柱金屬螯合親和層析技術(shù)和梯度透析復(fù)性方法獲得了高純度、可溶性好的蛋白。采用MTT比色試驗法、Annexin V細胞染色和雞胚尿囊膜血管新生實驗分析重組蛋白的生物學(xué)活性，證明本課題系統(tǒng)性優(yōu)化制備的rhVEGI-192A具有顯著的體外抑制內(nèi)皮細胞增殖、誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡以及體內(nèi)抑制血管新生的功效。因此本研究成功建立原核體系自動誘導(dǎo)表達人重組蛋白VEGI-192A的制備新工藝。
獲獎情況
- 本作品在第十屆“挑戰(zhàn)杯”聚暉廣東大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽中獲得一等獎。 我校第十屆“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽獲得特等獎
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻
- [1] Holleb AI, Folkman J. Tumor angiogenesis. CA Cancer J Clin, 1972, 22(4): 226-9. [2] Zhai Y, Yu j, Iruela Al, Huang WQ, et al. Inhibition of angiogenesis and breast cancer xenograft tumor growth by VEGI, a novel cytokine of the TNF superfamily . Int J Cancer 1999;82:131-6 [3] Zhai et al, A novel cytokine of the tumor necrosis factor family ,is an angiogenesis inhibitor that suppresses the growth of colon carcinomas in vivo. FASEB J 1999;13:181-9 [4] Hou W, Medynske D, Wu S, Lin X, Li LY. VEGI-192, a New Isoform of TNFSF15 , Specifically Eliminates Tumor Vascular Endothelial Cell and Suppresses Tumor Growth . Clin Cancer Res 2005,11(5):5595-5602 [5] Huang X, Wong MK, Zhao Q, Wang KZ,et al. Soluble recombinant endostatin purified from Escherichia coli: antiangiogenic activity and antitumor effect. Cancer Res. 2001 Jan 15;61(2):478-81. [7] F.William Studier. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.Protein Expression and Purification,2005 41:207-234
同類課題研究水平概述
- 血管內(nèi)皮生長抑制因子（VEGI）是一種新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性血管新生拮抗劑，屬于腫瘤壞死因子-15超家族成員，屬Ⅱ型跨膜糖蛋白。1997年Tan等率先通過篩選人臍靜脈內(nèi)皮細胞cDNA文庫發(fā)現(xiàn)了人VEGI，當時命名為TLI (TNF-like ligand 1)。隨后的生物活性研究發(fā)現(xiàn)，VEGI具有明顯抑制內(nèi)皮細胞增殖的作用，并由此而得名。VEGI全長基因為17Kb，由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個外顯子和三個內(nèi)含子構(gòu)成。按不同的拼接方式拼接產(chǎn)生三種mRNA，分別編碼由251、192、174個氨基酸殘基組成的VEGI-251、VEGI-192和VEGI-174異構(gòu)體。其中VEGI-192存在A、B兩種亞型。研究發(fā)現(xiàn)，全長的VEGI-174的可溶性很差，導(dǎo)致其抗血管新生效應(yīng)不佳。而體外表達純化獲得的VEGI-251重組蛋白幾乎不具備抑制血管新生的功能，目前原因未究。在進一步的研究發(fā)現(xiàn)VEGI不只是特異性的作用于內(nèi)皮細胞，它對于各種不同的腫瘤模型（其中包括乳腺癌、結(jié)腸癌等）都具有顯著的抗腫瘤療效。近年發(fā)現(xiàn)新的拼接異構(gòu)體rhVEGI-192A的抗血管新生活性更強，體外實驗表明rhVEGI-192A能顯著抑制牛主動脈內(nèi)皮細胞與人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖。此外，rhVEGI-192A還能抑制內(nèi)皮細胞形成血管狀結(jié)構(gòu)。體內(nèi)實驗研究顯示，在鼠路易士肺癌同種移植C57BL/6小鼠腫瘤模型中，系統(tǒng)性腹腔注射rhVEGI-192A可有效抑制異體移植的腫瘤生長，腫瘤內(nèi)血管化程度顯著降低。且對腎臟、肝臟顯示無毒性。同時作為血管內(nèi)皮細胞自分泌的抑制因子，更具激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)的功效。這說明rhVEGI-192A有望成為一種廣譜性的抗腫瘤藥物。自動誘導(dǎo)表達技術(shù)是由pET系統(tǒng)的發(fā)明者Bill studier于2005年提出來的一種更有效的蛋白表達系統(tǒng)。這種自動誘導(dǎo)蛋白表達系統(tǒng)是建立在pET系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，主要是通過改變培養(yǎng)基的成分，達到不需額外添加誘導(dǎo)劑即能表達目的蛋白。自誘導(dǎo)pET系統(tǒng)采用的培養(yǎng)基中含有乳糖和葡萄糖。當葡萄糖存在時，乳糖不被利用，其蛋白表達誘導(dǎo)作用即被抑制。從而保證細菌可以在不表達外源性蛋白的情況下，爆發(fā)式生長。而當葡萄糖消耗盡時，乳糖代謝物發(fā)揮誘導(dǎo)作用，由于此時宿主菌密度相當高，但與IPTG誘導(dǎo)相比，總體蛋白產(chǎn)量普遍能提高幾倍到幾十倍。到目前為止，這種表達技術(shù)已經(jīng)被很多的做蛋白結(jié)構(gòu)研究的實驗室所采用。
