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基本信息
- 項目名稱：
- 中國林蛙核糖核酸酶基因表達及抑制細菌生長活性的研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本研究項目利用基因克隆和表達的方法，以我國特有生物林蛙的基因組為模版，成功地克隆了兩個核糖核酸酶基因順序，兩者之間氨基酸順序的差異大約50%。在國際基因庫中發(fā)現(xiàn)他們分別與蛙類核糖核酸酶中：onconase和lectin樣酶分別具有76%和84%的順序的相似性。該順序結(jié)果已經(jīng)報國際GeneBank(EU384703和EU384704)。進一步我們通過誘導(dǎo)表達，得到了兩個基因的重組蛋白，初步分離純化后的抑菌試驗顯示，我們重組的lectin樣的酶具抑菌作用。而onconase樣的酶不具抑菌作用。
- 詳細介紹：
- 研究背景： 糖核酸酶A家族是一個蛋白質(zhì)家族，其成員在氨基酸一級結(jié)構(gòu)以及空間結(jié)構(gòu)上具有不同程度的相似性，因而具有不同程度的酶活性。 近年來，人們陸續(xù)從不同動物不同組織中發(fā)現(xiàn)許多種該酶家族的成員，它們除或多或少（或缺）地具有酶活性外，還具有其他的一些活性，如：抗病毒、抗腫瘤、免疫抑制、血管生成以及抑制細菌生長等方面的一些特殊的生物學(xué)活性。有關(guān)研究中最引人注目的是onconase，由于其來源的特殊性和抗人類腫瘤細胞生長的活性，它已成為抗腫瘤藥物的研究重點，目前正在進行第Ⅲb期臨床試驗。 由于哺乳動物核糖核酸酶受到人體內(nèi)抑制劑的作用，因而影響了酶的研究和進一步的應(yīng)用。兩棲動物來源的酶不受哺乳動物抑制劑的作用。因此，形成了一個熱點研究領(lǐng)域。 蛙類酶的研究國外主要集中在美洲豹蛙、牛蛙和日本稻田蛙。已發(fā)現(xiàn)十幾種核糖核酸酶，根據(jù)順序的相似性分為三個組，即：Onconase、Lectin以及Amphinase組。 本研究項目，利用我國特有的兩棲動物林蛙的基因，研究酶的特殊生物學(xué)活性，目前已經(jīng)克隆和表達了林蛙的兩個基因，并對其抑菌活性進行了初步的研究。 方法結(jié)果： 利用基因克隆和表達的方法，成功得到了兩個核糖核酸酶基因順序。這兩個順序均具有該酶家族的保守順序，兩者之間氨基酸順序的差異大約50%。在國際基因庫中發(fā)現(xiàn)他們與蛙類核糖核酸酶中：onconase和lectin樣的最相似的酶分別具有76%和84%的順序的相似性。該順序結(jié)果已經(jīng)報美國GeneBank（ EU384703和EU384704）。其次，我們得到了重組的酶蛋白，經(jīng)初步分離純化后的抑菌試驗結(jié)果顯示：我們重組的lectin樣的酶具抑菌作用；而onconase樣的酶不具抑菌作用。 項目特點： 本項目追蹤了國際相關(guān)研究的熱點問題，利用了我國特有的物種基因資源，表達了林蛙的兩個核糖核酸酶基因，為進一步的應(yīng)用打下了一個基礎(chǔ)，也彌補了我國在該領(lǐng)域的空白。 不足及展望： 實驗中，重組lectin樣核糖核酸酶顯示細胞毒性，給誘導(dǎo)表達帶來困難。希望經(jīng)進一步的研究，使其能夠大量表達，進一步為生物抗菌藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)；Onconase樣的重組酶的抗腫瘤活性研究，也將使我國在該類抗腫瘤酶的應(yīng)用方面趕超國際先進水平。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 本研究旨在發(fā)現(xiàn)我國特有兩棲動物林蛙的核糖核酸酶的基因及其功能，檢驗其抑菌作用，為進一步臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。 近年來，國外利用當(dāng)?shù)赝茴愘Y源獲得了多種核糖核酸酶的基因產(chǎn)物。這些酶除具有水解RNA的活性外，還具有一些特殊的生物學(xué)活性，如抗病毒以及抑菌等活性。 本研究以我國特有生物林蛙為對象，利用基因克隆和表達的手段獲得重組蛋白，并對其抗菌活性進行初步測定，以期發(fā)現(xiàn)具有抗菌活性的林蛙核糖核酸酶。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- 利用我國獨特基因資源，研究中國林蛙核糖核酸酶基因結(jié)構(gòu)、表達重組蛋白的抑菌作用。成果可望具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)。 追蹤國際相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)進展，其研究成果為本項目提供較好的實踐和理論支撐。圍繞生物制藥和抑菌的大課題，符合經(jīng)濟發(fā)展的需要，具有廣闊的應(yīng)用前景。 國外對蛙類核糖核酸酶的研究局限在牛蛙，豹蛙和日本稻田蛙；國內(nèi)林蛙的研究也限于細胞水平。本項目無疑將給該領(lǐng)域的研究帶來新的內(nèi)容。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 具有抗菌活性的多肽和蛋白質(zhì)生物制劑的出現(xiàn)，給抗菌治療開辟了廣闊的前景。 本實驗通過克隆和基因表達，探討我國兩棲動物核糖核酸酶抑菌的活性，為進一步研究該酶的特殊生物學(xué)活性打下基礎(chǔ)，填補我國林蛙核糖核酸酶研究的空白；同時也為林蛙核糖核酸酶應(yīng)用于細菌性疾病的治療打下基礎(chǔ)。表達我國林蛙核糖核酸酶、發(fā)現(xiàn)其抗菌作用，無疑將對我國林蛙的基因利用和生物制劑的抗菌研究和應(yīng)用產(chǎn)生一個新的影響。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 現(xiàn)今抗生素是治療感染性疾病的主要藥物，隨著抗菌藥物過多和過濫的使用，致使細菌對抗生素的耐藥性增加，療效下降，使抗生素的作用不再像以前那樣有效。具有抗菌活性的多肽和具有抗菌活性的蛋白質(zhì)生物制劑的應(yīng)用將會為抗菌治療帶來新的更加廣闊的前景。 近年來，越來越多的研究表明，核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase）不僅具有消化酶的功能，而且還可作為一種有選擇性的細胞毒素，具有抗病毒和抑制細菌等特殊的生物學(xué)功能, 在疾病的診斷和治療方面表現(xiàn)出重要的應(yīng)用價值。 本課題旨在從林蛙中克隆和表達具有抑制細菌活性的核糖核酸酶，并進行抑制細菌生長的抑制作用的研究。本研究從林蛙基因組中，克隆和表達了2種核糖核酸酶，通過檢索基因文庫， 發(fā)現(xiàn)它們分別與onconase和lectin樣的核糖核酸酶具有最大的相似性，分別為76%和84%。兩個順序均保留蛙類核糖核酸酶的保守區(qū)域，而兩者之間氨基酸順序具有大約50%的不同。初步的抑菌試驗顯示：其中l(wèi)ectin樣的重組酶具有抑制細菌生長的活性，而onconase樣的不具有抑菌活性。
獲獎情況
- 尚無
鑒定結(jié)果
- 尚無
參考文獻
- [1] W. Ardelt, S.M.Mikulski, K. Shogen. Amino acid sequence of anti-tumor protein from Rana pipiens oocytes and early embryos. J.Biol.Chem. 1991, 266:245-251. [2] YouDi Liao, HueyChung Huang, YinJen Leu, et al. Purification and cloning of cytotoxic ribonucleases from Rana catesbeiana. Nucleic Acids Research. 2000, 28(21): 4097-4104. [3] Torrent G, Rib M, Benito A, Vilanova M. Bactericidal activity engineered on human pancreatic ribonuclease and onconase. Mol. Pharm. 2009 Feb 4. [4] Yang D, Rosenberg HF, Chen Q, et al. Eosinophil-derived neurotoxin (EDN), an antimicrobial protein with chemotactic activities for dendritic cells. Blood. 2003, 102(9):3396-403. [5] Zhang J, Dyer KD, Rosenberg HF. Human RNase 7: a new cationic ribonuclease of the RNase A superfamily. Nucleic Acids Res. 2003, 31(2):602-7. [6] H.F. Rosenberg, Jianzhi Zhang, YouDi Liao, et al. Rapid diversification of RNase A super family ribonucleases from Bullfrog, Rana catesbeiana. J Mol.Evol .2001, 53:31-38.
同類課題研究水平概述
- 核糖核酸酶A超家族（Ribonuclease A superfamily; RNase A superfamily）是由一組結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)構(gòu)成的蛋白質(zhì)家族，它們在氨基酸殘基的組成和空間結(jié)構(gòu)上的相似性決定了它們具有相似的酶活性。最早發(fā)現(xiàn)并深入研究過的牛胰核糖核酸酶就是這一大家族成員的原型。它們共同的酶活性表現(xiàn)為：在組成RNA的核苷酸殘基的3’端水解RNA。這一點提供了我們檢測RNase酶活性的基本方法。 目前，已經(jīng)有許多核糖核酸酶家族的成員被分離和表達出來。它們來源于不同的物種，包括哺乳動物、嚙齒動物、爬行動物、兩棲動物等，以及同一物種的不同器官，具有不同程度的酶活性和廣泛的生物學(xué)活性，如：抗病毒、抑制細菌生長、促進血管生成、免疫抑制以及抑制腫瘤細胞生長等活性，在治療愛滋病、抑制細菌病毒感染和人類腫瘤治療等臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域具有廣闊的遠景，已成為當(dāng)前一個活躍的研究領(lǐng)域。例如，人類基因組中存在有13種核糖核酸酶。其中，嗜酸性粒細胞來源的神經(jīng)毒素（EDN，RNase2）和堿性蛋白（ECP，RNase3）分別顯示出抑制細菌和病毒生長的活性；RNase5被認(rèn)為是血管生成素（angiogenin）；RNase7 顯示出抑制細菌生長的功能。 為了進一步證實某些酶的特殊生物活性，人們試圖在哺乳動物和嚙齒動物中尋找這些酶的對應(yīng)物（conterparts），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：小鼠核糖核酸酶也具有抑制病毒繁殖和抑制細菌生長的功能。 由于哺乳動物胎盤來源的核糖核酸酶抑制劑對哺乳動物核糖核酸酶存在普遍的抑制作用，阻礙了酶與其受體的結(jié)合，進而抑制了酶的應(yīng)用。因此，兩棲類動物來源的酶就成了人們尋找這種可為人類利用的具有細胞毒性的酶的熱點研究領(lǐng)域。 目前，國內(nèi)外同類課題的大量文獻，有關(guān)核糖核酸酶的研究沒有涉及中國林蛙，只是在豹蛙、稻田蛙、和牛蛙中做了相關(guān)的報道。而其他有關(guān)于林蛙的研究只是關(guān)于抗菌多肽的，沒有在分子水平對林蛙的核糖核酸酶進行如此深入的研究。 現(xiàn)今，國外有關(guān)核糖核酸酶的抗腫瘤研究已經(jīng)達到臨床試驗階段，這也為核糖核酸酶在抑菌方面的應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。縱觀其他人所做的研究發(fā)現(xiàn)：核糖核酸酶家族中的某些成員具有抑菌作用是較為肯定。所以，我們以林蛙核糖核酸酶的抑制細菌活性的研究，作為研究我國特有兩棲動物特殊生物學(xué)活性的開始。
