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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 快速檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌的納米生物傳感器研發(fā)
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 大類：
- 科技發(fā)明制作A類
- 簡(jiǎn)介：
- 本研究的對(duì)象是腸出血型大腸桿菌（EHEC）。EHEC具有起病急、傳播快、涉及范圍廣的特點(diǎn)。本研究致力于快速檢測(cè)EHEC的納米生物傳感器研發(fā)。 一方面利用超聲乳化法以PCDA單體為原料獲得實(shí)驗(yàn)所需的囊泡，作為信號(hào)傳導(dǎo)裝置。另一方面選取能與EHEC的脂多糖特異性結(jié)合的DNA寡核苷酸鏈作為識(shí)別元件。最后將氨基化適配體通過酰胺鍵修飾到囊泡表面，制得納米生物傳感器，最后利用比色從而檢測(cè)EHEC。
- 詳細(xì)介紹：
- 生物傳感器是以抗體、酶等生物材料為識(shí)別元件，來特異地結(jié)合各種配體，通過信號(hào)傳導(dǎo)裝置將這些生物過程轉(zhuǎn)化為電、光等信號(hào)，從而定性或定量地檢測(cè)各種配體，因此本研究以EHEC特異性適配體作為識(shí)別元件，以PCDA納米囊泡作為信號(hào)傳導(dǎo)裝置，組裝成納米生物傳感器，通過比色直觀地檢測(cè)EHEC。 選擇PCDA單體是因?yàn)槠渚哂须p親性、聚合性和變色性。PCDA一端親脂，一端親水，中間是典型的丁二炔結(jié)構(gòu)。這種雙親性分子易于制備成囊泡。我們將PCDA單體超聲乳化成透明色，再用254 nm紫外照射至藍(lán)色，獲得實(shí)驗(yàn)所需的囊泡。另外，本研究選取能與EHEC的脂多糖特異性結(jié)合的DNA寡核苷酸鏈作為識(shí)別元件，通過截短E17F-72適配體，預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)，最終合成并用FITC熒光素標(biāo)記。然后，我們將氨基化適配體通過酰胺鍵修飾到囊泡表面，此時(shí)，640 nm處的PDA特征吸收峰不變，260 nm 處出現(xiàn)DNA的吸收峰，證明組裝成功。 制得后進(jìn)行方法學(xué)的評(píng)價(jià)，分別對(duì)其穩(wěn)定性、檢測(cè)時(shí)間、靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)納米生物傳感器進(jìn)行完善。 本研究構(gòu)建的適配體-聚丁二炔納米囊泡生物傳感器有望成為病原菌POCT檢測(cè)的新方法，而且更換適配體又可以應(yīng)用于其他病原菌的檢測(cè)，特別在疾病暴發(fā)的預(yù)防和農(nóng)村基層醫(yī)院等條件相對(duì)落后地區(qū)的病原菌檢測(cè)方面具有很好的推廣價(jià)值，是我國(guó)處理此類大規(guī)模突發(fā)流行病事件的有利工具。
作品圖片
作品專業(yè)信息
設(shè)計(jì)、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點(diǎn)、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)
- 目的： 利用聚丁二炔材料，制備一種核酸適配體的聚丁二目的： 利用聚丁二炔材料，制備一種核酸適配體的聚丁二炔納米生物傳感器快速檢測(cè)標(biāo)本中的腸出血性大腸埃希菌（EHEC）O157：H7。 基本思路： 一方面用聚丁二炔材料制成納米囊泡，另一方面對(duì)已有的腸出血性大腸埃希菌適配體序列進(jìn)行截短設(shè)計(jì)，并通過酰胺化反應(yīng)修飾到PCDA納米囊泡的表面，實(shí)現(xiàn)生物傳感器的組裝。利用比色來快速定性或半定量檢測(cè)溶液中的EHEC，并進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。 創(chuàng)新點(diǎn)： 1）構(gòu)建用于快速檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌的納米生物傳感器，為臨床、疫區(qū)EHEC的初篩提供新方法。 2）開發(fā)納米生物傳感器的化學(xué)組裝技術(shù)，解決納米生物傳感器用于腸道病原菌的快速檢測(cè)研究中的難題。 3）操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，靈敏度高，特異性強(qiáng)。 4）更換系統(tǒng)中的適配體就可以應(yīng)用于其他病原菌的檢測(cè)。 技術(shù)關(guān)鍵： 1）PCDA納米囊泡的制備 2）表征腸道病原菌特異性功能分子的篩選與制備。 3）納米生物傳感器功能化組裝。 4）腸道病原菌的快速檢測(cè)傳感器檢測(cè)技術(shù)研究。 主要技術(shù)指標(biāo)： 1）驗(yàn)證方法：激光共聚焦、透射電鏡等方法對(duì)該法進(jìn)行了驗(yàn)證。 2）檢測(cè)時(shí)間：在2h內(nèi)可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。 3）靈敏度：傳感器CR%值隨著EHEC菌液濃度的增加逐漸增加，檢測(cè)限為104CFU/ml。 4）特異度：與15中其他細(xì)菌均無交叉反應(yīng)。 5）準(zhǔn)確度：檢測(cè)臨床標(biāo)本198例，該方法的假陽性率1.5%；假陰性率0%；準(zhǔn)確率高達(dá)98.5%。
科學(xué)性、先進(jìn)性
- 繼1982年美國(guó)第一次暴發(fā)該病以來，EHEC在全球范圍內(nèi)已引發(fā)了數(shù)百起暴發(fā)事件，給人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成了重大威脅。為此，建立一種快速、靈敏度高及操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法尤為迫切。 目前傳統(tǒng)的培養(yǎng)法耗時(shí)耗力，存在操作步驟繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。近年來，許多基于不同原理的檢測(cè)方法得到長(zhǎng)足的發(fā)展，出現(xiàn)了一些新興檢測(cè)方法，如分子生物學(xué)法、ELISA 法、免疫磁珠分離法、流式細(xì)胞儀法及基因芯片法等，與傳統(tǒng)方法相比，這些方法具有一定的優(yōu)勢(shì)，但同樣也存在著較高的假陽性且需要配備專門的人員和儀器，操作復(fù)雜，限制了檢驗(yàn)工作的準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便。 因此建立一個(gè)針對(duì)EHEC快速、簡(jiǎn)便、靈敏、特異的檢測(cè)方法顯得十分重要。本課題研究納米生物傳感器，它是材料科學(xué)和生物技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，從而開發(fā)納米生物傳感器的化學(xué)組裝技術(shù)，構(gòu)建用于快速、高靈敏檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌的納米生物傳感器，這種新建立的實(shí)驗(yàn)方法，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床、疫區(qū)EHEC的初篩及快速檢測(cè)，為衛(wèi)生檢驗(yàn)、臨床檢驗(yàn)提供新方法。
獲獎(jiǎng)情況及鑒定結(jié)果
- 無
作品所處階段
- 中試階段
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
- 以專利轉(zhuǎn)讓
作品可展示的形式
- 實(shí)物、產(chǎn)品
使用說明,技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì),適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說明,市場(chǎng)分析,經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測(cè)
- 使用說明及技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)： 本產(chǎn)品EHEC O157: H7檢測(cè)試劑盒主要用于臨床定性檢測(cè)大腸埃希菌O157: H7。檢測(cè)時(shí)，取前處理好的糞便標(biāo)本于試劑中，同時(shí)做空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，37℃孵育1h后，比色檢測(cè)計(jì)算CR%值。CR%=15%為cut off值，當(dāng)標(biāo)本CR%值≥15%時(shí)，提示可能有大腸埃希菌 O157:H7感染。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、靈敏度高、特異度強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、保存方便等特點(diǎn)。 適用范圍及推廣前景的技術(shù)說明及市場(chǎng)分析、經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測(cè)： 本產(chǎn)品適用于臨床定性檢測(cè)大腸埃希菌EHEC O157: H7的糞便標(biāo)本。 現(xiàn)在對(duì)于病原菌快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)，仍是臨床上面臨的一大難題。本產(chǎn)品方法操作十分簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，可替代現(xiàn)有的檢測(cè)方法，尤其對(duì)腸出血性大腸埃希菌暴發(fā)的預(yù)防方面以及農(nóng)村基層醫(yī)院、衛(wèi)生防疫站等條件相對(duì)落后地區(qū)的病原菌檢測(cè)方面具有很好的推廣價(jià)值，是我國(guó)處理此類大規(guī)模突發(fā)流行病事件的有利工具。在國(guó)內(nèi)外都具有廣闊的社會(huì)應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)前景以及良好的應(yīng)用轉(zhuǎn)化前景。
同類課題研究水平概述
- 大腸桿菌是人及各種動(dòng)物腸道中的常居菌，常隨糞便從人及動(dòng)物體內(nèi)排出，廣泛散播于自然界。它被用來作為飲用水或其他水源糞便污染的指標(biāo)。大多數(shù)大腸桿菌菌株均是不致病的，但是某些致病性大腸桿菌，特別是腸出血性大腸桿菌（enterohaemorrhagic escherichia coli, EHEC）可以引起人類嚴(yán)重的腸道傳染病，引起人們廣泛的關(guān)注。 大腸桿菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法包括多管發(fā)酵法（multiple-tube fermentation, MTF）和濾膜法（membrane filter, MF）等，存在操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)（一般需要24～72 h才能得到結(jié)果）等缺點(diǎn)，難以滿足傳染病的快速診斷和污染源的快速確定。近年來，許多基于不同檢測(cè)原理的方法已得到長(zhǎng)足的發(fā)展，比如分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法、細(xì)胞學(xué)方法以及質(zhì)譜法]等等。與傳統(tǒng)方法相比，這些方法具有一定的優(yōu)勢(shì)，但所需的檢測(cè)時(shí)間仍然較長(zhǎng)，且需要昂貴的儀器。因此本研究的快速準(zhǔn)確檢測(cè)大腸桿菌的納米生物傳感器方法具有重要意義。 當(dāng)前對(duì)于EHEC的檢測(cè)，已有應(yīng)用納米金標(biāo)記磁珠分離電化學(xué)檢測(cè)DNA方法。以納米量子點(diǎn)為DNA標(biāo)記,夾心法為目標(biāo)捕獲方法,通過磁珠分離富集途徑,利用電化學(xué)方法檢測(cè)納米金標(biāo)記在碳電極表面的還原信號(hào),建立納米生物傳感器檢測(cè)技術(shù)。還有建立了一種采用電化學(xué)阻抗譜技術(shù)快速檢測(cè)大腸桿菌O157:H7的生物傳感器,它是通過石英晶體金電極表面附著一層蛋白A膜來固定抗體的。此外還有酶免疫傳感器檢測(cè)等方法。
