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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 在油/水兩相界面中利用酶抑制法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥
- 來(lái)源：
- 第十一屆“挑戰(zhàn)杯”國(guó)賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 食品和環(huán)境中的殘留農(nóng)藥嚴(yán)重危害人們的健康，快速檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥具有廣泛的應(yīng)用前景。此外，有機(jī)相體系中的酶催化反應(yīng)是研究的熱點(diǎn),多數(shù)農(nóng)藥難溶于水,研究有機(jī)相存在條件下的膽堿酯酶活性及其抑制具有重要的意義。根據(jù)農(nóng)藥、底物和產(chǎn)物以及酶本身的溶解性,巧妙設(shè)計(jì)兩相體系,使油相中的農(nóng)藥和底物在油/水界面上和膽堿酯酶作用,生成水溶性的產(chǎn)物進(jìn)入水相并給出電化學(xué)信號(hào)。將有機(jī)磷農(nóng)藥加入到有機(jī)相中，會(huì)抑制兩相界面中酶的活性。通過(guò)電化學(xué)信號(hào)的變化直接檢測(cè)農(nóng)藥對(duì)酶的抑制程度，檢測(cè)農(nóng)藥濃度范圍在50ng/ml~100ug/ml之間。 研究膽堿酯酶在有機(jī)溶劑存在條件下的生物催化和抑制有助于建立農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)新技術(shù),是有機(jī)相酶學(xué)的深入,具有一定的科學(xué)意義。此外，膽堿酯酶抑制法和方波伏安技術(shù)相結(jié)合檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的含量的方法，具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、分析速度快、靈敏度高、檢測(cè)速度快、背景信號(hào)低等優(yōu)點(diǎn)。研究具有重要的應(yīng)用前景。
- 詳細(xì)介紹：
- 隨著農(nóng)業(yè)發(fā)展，農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)越來(lái)越依賴于農(nóng)藥的使用，農(nóng)藥的不合理使用使得水體、土壤和農(nóng)產(chǎn)品污染嚴(yán)重超標(biāo)，農(nóng)藥殘留引起的中毒事故頻繁發(fā)生。我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品往往因農(nóng)藥殘留超標(biāo)難以跨越國(guó)外“綠色壁壘”，給企業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了保障人民的身體健康，滿足進(jìn)出口貿(mào)易的需要，研究農(nóng)藥殘留速測(cè)技術(shù)具有重要的意義。 用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的方法有分光光度法、氣相色譜法、液相色譜法、同位素標(biāo)記法、核磁共振波譜法、色質(zhì)聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳等。多數(shù)檢測(cè)方法儀器昂貴、操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、需要專業(yè)人員操作，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的實(shí)際需要。有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥能強(qiáng)烈抑制膽堿酯酶的活力，抑制率與農(nóng)藥濃度正相關(guān)，常常用于農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)。它能在較短的時(shí)間內(nèi)篩選出大量的超標(biāo)樣品，縮小定量檢測(cè)范圍，是復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室方法的有效補(bǔ)充。利用酶抑制原理檢測(cè)農(nóng)藥殘留常常采用速測(cè)卡和比色法。其中速測(cè)卡不能定量，比色法靈敏度較低、不便于微型化。 通常膽堿酯酶在水相中行使催化性能，但是多數(shù)農(nóng)藥不易溶于水，需要用有機(jī)溶劑提取和富集，研究有機(jī)相條件下的膽堿酯酶活性及其抑制具有重要意義。反應(yīng)池中上層為異辛烷的油相，其中有淺黃色的靛酚乙酸酯；下層水相，溶有膽堿酯酶，在兩相界面上膽堿酯酶將上層中的靛酚乙酸酯催化成水溶性靛酚，進(jìn)入下層，從而使上層淺黃色褪去，下層變成紅色。加入甲基對(duì)硫磷農(nóng)藥時(shí)，膽堿酯酶活性受到抑制，上下層的顏色變化程度被抑制。在水相中插入電極檢測(cè)其電化學(xué)信號(hào)的改變。酶的濃度逐漸增加，顏色變化逐漸增強(qiáng)。沒(méi)有酶存在，上下層顏色不變化。酶濃度很高時(shí)，上層大量的靛酚乙酸酯被水解，顏色退去，水解產(chǎn)物靛酚進(jìn)入下層顏色變紅。 將電極插入到水相中，用循環(huán)伏安法研究反應(yīng)過(guò)程。膽堿酯酶催化靛酚乙酸酯水解產(chǎn)生靛酚，沒(méi)有酶存在時(shí)，只有靛酚乙酸酯的一對(duì)氧化還原峰PI; 酶濃度很高時(shí)，靛酚乙酸酯完全水解，他的氧化還原峰PI消失，出現(xiàn)產(chǎn)物靛酚的氧化還原峰PII; 通過(guò)研究不同濃度的酶，我們清楚地看到這個(gè)變化的過(guò)程。通常膽堿酯酶在水相中行使催化功能，這里的結(jié)果意味著膽堿酯酶在油/水兩相界面上仍然具有活性，可以在有機(jī)相條件下進(jìn)行農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。 為了選擇合適的靛酚乙酸酯濃度，我們研究了這個(gè)濃度的影響。濃度過(guò)低，酶催化很慢，顏色幾乎不變，濃度較高，反應(yīng)速度加快，顏色變化明顯。電化學(xué)信號(hào)也給出相似的結(jié)論，靛酚乙酸酯濃度越高，產(chǎn)物靛酚的電化學(xué)信號(hào)越高（酶濃度高，所以只有靛酚的一對(duì)峰）。 循環(huán)伏安法是研究物質(zhì)氧化還原特性的工具，但不適合定量分析。我們采用方波伏安法定量研究農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制關(guān)系。（方波伏安法信號(hào)靈敏，檢測(cè)速度快，一個(gè)讀數(shù)只要幾秒時(shí)間（循環(huán)伏安需要幾分鐘或更長(zhǎng)），能夠自動(dòng)扣除背景。） 農(nóng)藥濃度很高時(shí)，酶幾乎完全被抑制，只有靛酚乙酸酯的電化學(xué)信號(hào)；沒(méi)有農(nóng)藥時(shí)，所有靛酚乙酸酯被水解為靛酚，只有靛酚的電化學(xué)信號(hào)；中間濃度的農(nóng)藥既有靛酚乙酸酯的信號(hào)，也有靛酚的信號(hào)，用兩者峰電流比值表示酶活力, 農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制率則表示為這個(gè)比值的下降百分比。最終發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥在高濃度范圍時(shí)其抑制率與農(nóng)藥濃度成正比，在低濃度時(shí)其抑制率與農(nóng)藥的Ln值成正比，檢測(cè)下限為50 ng/ml。 通常認(rèn)為膽堿酯酶在水相中行使催化功能，研究發(fā)現(xiàn)膽堿酯酶在油/水兩相界面上具有活性，工作是有機(jī)相酶學(xué)的深入，意味著農(nóng)殘檢測(cè)能夠在兩相中進(jìn)行，檢測(cè)更加方便、靈敏。此外，采用電化學(xué)方法研究?jī)上嘟缑嬷械哪憠A酯酶活性及其抑制，有助于便攜式農(nóng)藥殘留傳感技術(shù)的發(fā)展，具有廣泛的應(yīng)用前景。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥的不合理使用,帶來(lái)環(huán)境和食品的污染,為了保障人民身體健康和生命安全,農(nóng)藥殘留檢測(cè)至關(guān)重要。有機(jī)磷農(nóng)藥能抑制膽堿酯酶活力,常用于農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)。研究思路是采用不相溶的兩相,上層有機(jī)相溶有靛酚乙酸酯,下層水相溶有膽堿酯酶,在兩相的界面上靛酚乙酸酯被酶水解成水溶性的靛酚,擴(kuò)散到水中,發(fā)生電信號(hào)的改變。有機(jī)相中的有機(jī)磷農(nóng)藥會(huì)抑制兩相界面上酶的活性,通過(guò)電化學(xué)信號(hào)的變化檢測(cè)農(nóng)藥的濃度。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 有機(jī)相體系中的酶催化反應(yīng)是研究的熱點(diǎn),多數(shù)農(nóng)藥難溶于水,研究有機(jī)相存在條件下的膽堿酯酶活性及其抑制具有重要的意義。根據(jù)農(nóng)藥、底物和產(chǎn)物以及酶本身的溶解性,巧妙設(shè)計(jì)兩相體系,使油相中的農(nóng)藥和底物在油/水界面上和膽堿酯酶作用,生成水溶性的產(chǎn)物進(jìn)入水相并給出電化學(xué)信號(hào)。研究膽堿酯酶在有機(jī)溶劑存在條件下的生物催化和抑制有助于建立農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)新技術(shù),是有機(jī)相酶學(xué)的深入,具有一定的科學(xué)意義。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 不合理使用農(nóng)藥造成環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品的嚴(yán)重污染。為了保障人民身體健康,滿足進(jìn)出口貿(mào)易需要,大力開展農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù),監(jiān)測(cè)環(huán)境農(nóng)藥污染、控制農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留至關(guān)重要。將膽堿酯酶抑制法和方波伏安技術(shù)相結(jié)合檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的含量,具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、分析速度快、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn),對(duì)于合理使用農(nóng)藥,維護(hù)食品安全,保護(hù)生態(tài)環(huán)境,保障人類健康,避免和減少不必要的農(nóng)業(yè)損失等都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥是我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中使用的主要產(chǎn)品，低濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯農(nóng)藥能強(qiáng)烈抑制膽堿酯酶的活力，一直被用作環(huán)境中有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥污染快速檢測(cè)的專用方法。然而，一個(gè)最大的問(wèn)題是這兩類農(nóng)藥幾乎都是不溶于水的。研究有機(jī)相存在條件下的膽堿酯酶活性及其抑制具有重要的意義。 大部分有機(jī)磷毒劑和膽堿酯酶的底物是不溶于水的，而酶是兩親性的，能夠分布到兩相體系的界面上。研究表明靛酚乙酸酯的水解產(chǎn)物靛酚溶于水，通過(guò)界面進(jìn)入水相，顯示出很好的電化學(xué)信號(hào)。本試驗(yàn)利用方波伏安法檢測(cè)農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制率。 研究得知：底物靛酚乙酸酯本身具有良好的電化學(xué)響應(yīng)，盡管靛酚乙酸酯易溶于異辛烷，但它在水中也有輕微的溶解，能自發(fā)的從有機(jī)相中滲透到水相中，最后達(dá)到平衡；隨著酶反應(yīng)的進(jìn)行，底物信號(hào)逐步下降，產(chǎn)物信號(hào)逐步上升；原本上層的黃色變?yōu)闊o(wú)色溶液，而下層的無(wú)色透明水相變成紅色。說(shuō)明酶在兩相表面具有活性，催化靛酚乙酸酯水解；水解反應(yīng)還與水相體積有關(guān)，水相體積越小，其水解越容易達(dá)到平衡，因?yàn)樾◇w積水相具有濃縮效應(yīng)，增大產(chǎn)物的濃度；隨著甲基對(duì)硫磷濃度的增加，酶活性幾乎被完全抑制。
獲獎(jiǎng)情況
- 論文在國(guó)際刊物Electrochemistry Communications （影響因子4.186, I區(qū)）上發(fā)表，該刊是電化學(xué)領(lǐng)域的權(quán)威期刊: Square wave voltammetry assay of organophosphorus inhibition on cholinesterase in two phases of isooctane/water, Electrochemistry Communications 2009,11,1022-1025 獲浙江得省第十一屆“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽一等獎(jiǎng)。
鑒定結(jié)果
參考文獻(xiàn)
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同類課題研究水平概述
- 農(nóng)藥不合理使用帶來(lái)了農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留問(wèn)題,危及人們的健康和生命安全,作為技術(shù)壁壘也嚴(yán)重影響著農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易。出于保障消費(fèi)者合法權(quán)益、增強(qiáng)農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的需要,對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留進(jìn)行科學(xué)檢測(cè)至關(guān)重要。 早期農(nóng)藥殘留量分析方法局限于化學(xué)法、比色法和生物測(cè)定法, 方法欠專一, 靈敏度低。后來(lái),色譜技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了農(nóng)藥殘留分析的高速發(fā)展。目前常規(guī)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)主要有：理化分析法、色譜技術(shù)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法、熒光分析法等,但都存在耗時(shí)長(zhǎng)、成本高等缺點(diǎn),難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的實(shí)際需要。 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶有抑制作用,其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)。酶抑制法的原理足利用這一反應(yīng)特性,用濾紙片或電極作為載體,將膽堿酯酶吸附在上面,加入顯色劑,如果酶的活性沒(méi)有被抑制,則生成的產(chǎn)物可以使顯色劑顯色,如果被測(cè)樣品中含有農(nóng)藥殘留則酶活性被抑制不能生成水解產(chǎn)物,顯色劑不顯色,根據(jù)顏色的變化或測(cè)定酶與某種特定化合物反應(yīng)的物理化學(xué)信號(hào)的變化,可判斷足否存在有機(jī)磷農(nóng)藥。酶抑制法作為一種快速檢測(cè)果蔬中農(nóng)藥殘留的篩選方法,與傳統(tǒng)的化學(xué)分析和儀器分析法相比,克服了分析時(shí)間長(zhǎng)、成本昂貴等缺陷。它直接用抑制率高低來(lái)表示農(nóng)藥殘留程度的大小,直觀、簡(jiǎn)便、靈敏,并能在較短的時(shí)間內(nèi)篩選出大量的超標(biāo)樣品,進(jìn)而縮小定量檢測(cè)范圍,將一部分含農(nóng)藥殘留量高的果蔬產(chǎn)品阻擋在市場(chǎng)之外,避免中毒事件的發(fā)生,以達(dá)到保護(hù)消費(fèi)者身體健康的目的。 自從上世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)酶在接近無(wú)水的有機(jī)溶劑中起催化作用以來(lái),有機(jī)介質(zhì)中的酶催化反應(yīng)成為研究的熱點(diǎn),它具有許多優(yōu)點(diǎn)：1）許多有機(jī)底物在有機(jī)溶劑中有較大的溶解度；2）在有機(jī)溶劑中酶的熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性比在水中有明顯提高；3）在有機(jī)溶劑中某些反應(yīng)過(guò)程的熱力學(xué)平衡可以向期望的方向移動(dòng),可以發(fā)生水溶液中不可能進(jìn)行的反應(yīng),而且還能抑制因水產(chǎn)生的負(fù)反應(yīng)；4）在有機(jī)溶劑中酶分子構(gòu)象表現(xiàn)出比在水溶液中更有剛性的特點(diǎn),因而可以通過(guò)選擇不同性質(zhì)的溶劑來(lái)調(diào)控酶的某些選擇性；5）產(chǎn)物的分離與純化比在水中容易,另外酶不溶于有機(jī)溶劑有利于酶的回收與再利用等；6）無(wú)微生物污染。酶在有機(jī)介質(zhì)中反應(yīng)的研究在國(guó)內(nèi)外引起廣泛的重視,并取得可喜的進(jìn)展。 研究膽堿酯酶在有機(jī)溶劑存在條件下的生物催化和抑制有助于利用膽堿酯酶抑制法建立農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)新技術(shù),是有機(jī)相酶學(xué)的深入,具有一定的科學(xué)意義。
