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基本信息
- 項目名稱：
- 產(chǎn)植酸酶及中性內(nèi)切纖維素酶畢赤酵母基因工程菌的構(gòu)建及表達(dá)研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本研究實現(xiàn)植酸酶和中性內(nèi)切纖維素酶基因在畢赤酵母中共表達(dá)，在節(jié)約資源，降低生產(chǎn)成本，提高飼料利用率，減少環(huán)境污染等方面具有重要的現(xiàn)實意義，目前國內(nèi)外未見同類報道。
- 詳細(xì)介紹：
- 飼料中的磷一般以植酸（肌醇六磷酸）的形式存在，是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，其自然分解率很低，豬和禽等單胃動物體內(nèi)又很少有能分解植酸磷的酶存在，一般很難被動物直接利用，常通過添加骨粉或磷酸鹽來補充礦物質(zhì)，大量的植酸磷不能被利用而從糞便中排除，環(huán)境污染嚴(yán)重。因此植酸酶的添加能有效提高飼料中磷的利用率，促進(jìn)動物生長，減少環(huán)境污染。 由于禽畜一般以植物性飼料為主，植物當(dāng)中含有大量的纖維素和半纖維素，除少數(shù)單胃動物能吸收一部分，絕大多數(shù)被直接排出體外，造成飼料利用率大大降低，且污染環(huán)境。另一方面，我國如秸稈等豐富廉價的纖維素資源浪費嚴(yán)重，還易造成環(huán)境污染。纖維素酶的利用能大大提高飼料纖維素利用率，促進(jìn)動物營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。 將植酸酶和中性內(nèi)切纖維素酶在畢赤酵母中共表達(dá)，使之同時具有兩種酶活性，將大大降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益，減少環(huán)境污染。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 利用基因工程手段使植酸酶和纖維素酶在酵母中共表達(dá)將可以大大降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益，也為飼料酶制劑的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。 本研究是在生物化學(xué)實驗室已構(gòu)建植酸酶phyAm基因重組酵母株GS115-phyAm的基礎(chǔ)上，運用基因工程技術(shù)，將成功構(gòu)建并線性化處理的重組載體pPICZα-End轉(zhuǎn)入GS115-phyAm中。經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)、酶活力測定最終篩選獲得共表達(dá)且活性較高的轉(zhuǎn)化子。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨特之處
- 目前纖維素酶基因絕大多數(shù)在大腸桿菌中表達(dá)，酶活較低，畢赤酵母為真菌表達(dá)系統(tǒng)，具有表達(dá)量高、易于工業(yè)發(fā)酵等優(yōu)點。 將植酸酶和中性內(nèi)切纖維素酶的基因在酵母系統(tǒng)中共表達(dá)，使其同時具有兩種酶的活性，這在節(jié)約資源，降低生產(chǎn)成本，提高飼料利用率等方面具有重要的現(xiàn)實意義，目前國內(nèi)外未見同類報道。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 飼料中的磷一般以植酸的形式存在，為抗?fàn)I養(yǎng)因子，其自然分解率很低，植酸酶能有效分解植酸，促進(jìn)家禽對磷的吸收。禽畜一般以植物性飼料為主，植物當(dāng)中含有大量的纖維素和半纖維素，除少數(shù)單胃動物能吸收一部分，絕大多數(shù)被直接排出體外，纖維素酶能有效分解纖維素。本研究實現(xiàn)中性內(nèi)切纖維素酶和植酸酶的共表達(dá)，為降低飼用酶的生產(chǎn)成本，提高飼料利用率，減少環(huán)境污染提供了實驗依據(jù)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 植酸酶和纖維素酶在飼料中的良好作用已得到廣泛證實。本研究在生物化學(xué)實驗室構(gòu)建的含植酸酶phyAm基因并經(jīng)過密碼子優(yōu)化的重組酵母株GS115-phyAm的基礎(chǔ)上，根據(jù)枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)中性內(nèi)切纖維素酶基因序列設(shè)計引物，采用PCR擴增獲得去除信號肽后約1.4 kb的中性內(nèi)切纖維素酶基因片段，以此片段構(gòu)建pPICZα-End載體，經(jīng)SacⅠ酶切線性化處理，通過電擊轉(zhuǎn)化法將線性化的pPICZα-End載體導(dǎo)入GS115-phyAm中。經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)、酶活力測定，篩選獲得共表達(dá)轉(zhuǎn)化子GS115-phyAm-E-4、GS115-phyAm-E-8，其植酸酶活力分別為8667U/mL、7280U/mL，分別為密碼子優(yōu)化重組酵母株GS115-phyAm的18.2%和15.3%；中性內(nèi)切纖維素酶活分別達(dá)到256.4U、298.6U，分別為原始菌株的4.02倍和4.68倍。
獲獎情況
- 榮獲本屆“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽校內(nèi)選拔一等獎； 榮獲本屆“挑戰(zhàn)杯” 大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽省級選拔一等獎
鑒定結(jié)果
參考文獻(xiàn)
- 1.陳惠，趙海霞，王紅寧等. 植酸酶基因中稀有密碼子的改造提高其在畢赤酵母中的表達(dá)量，中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2005,21(2):171-175 2.張莉，趙耘，王郡美.植酸酶在飼料工業(yè)中的應(yīng)用及其研究進(jìn)展.畜牧獸醫(yī)科技信息，2006，8：7-9 3.李明華，張大偉等. 飼料纖維素的研究與應(yīng)用進(jìn)展.飼料與畜牧，2006，4：28-32 4.沈雪亮，夏黎明，劉景晶．浙江大學(xué)學(xué)報．Recombination and expression of cellulase E5 gene (J). 2001, 35(6): 640-646 5.陳惠，胥兵等.內(nèi)切葡聚糖酶基因在巨大芽孢桿菌匯總的表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究.遺傳，2008，30（5）：649-654
同類課題研究水平概述
- 植酸酶和纖維素酶在飼料工業(yè)中的重要作用已得到廣泛證實。 目前對植酸酶phyA基因研究的較多，如霍丹群，范守城等（2007），將phyA基因克隆并在大腸桿菌中高效表達(dá)，使其活性達(dá)到1193U；黃添孫和駱旭添（2008）將植酸酶phyA基因轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母中，優(yōu)化表達(dá)條件后，植酸酶酶活達(dá)到106U/mL;唐光桂等（2008）利用透明顫菌血紅蛋白在低氧條件下提高畢赤酵母中植酸酶的表達(dá)，使其酶活達(dá)到249U/mL；陳惠等（2005）已構(gòu)建植酸酶phyAm基因重組酵母株GS115-phyAm，活性達(dá)47600U/mL。 目前已克隆出基因的纖維素酶還十分有限，絕大多數(shù)已克隆到的纖維素酶基因都在大腸桿菌中得到表達(dá)，但表達(dá)量比較低。沈雪亮等(2001)已經(jīng)將纖維素酶E5基因在E.coli中進(jìn)行了克隆與表達(dá)，并且基因重組后的大腸桿菌能高效表達(dá)E5基因并將產(chǎn)物分泌出胞外，培養(yǎng)液中可檢測到的CMCase活力達(dá)31.6 U。丁少軍等(2006)將中性內(nèi)切纖維素酶在畢赤酵母中表達(dá)，并篩選出高拷貝菌株，實現(xiàn)了高水平表達(dá)。胥兵等(2008)將內(nèi)切纖維素酶基因在巨大芽胞桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，可檢測到的酶活為889 U。利用巨大芽胞桿菌表達(dá)發(fā)現(xiàn)內(nèi)切纖維素酶對宿主菌具有毒性，嚴(yán)重影響工程菌的生長，從而影響表達(dá)產(chǎn)量。 目前基因共表達(dá)在生物醫(yī)學(xué)工程中運用較多，如周春麗等（2008）構(gòu)建了pCDR1Th表位和CTLA4Ig雙基因共表達(dá)真核表達(dá)載體；曹素芳和黃青云（2008）對共表達(dá)C48-1H基因和雞IL-18基因重組DNA疫苗的免疫保護性做了研究；馬彥彬，戴五星等（2008）構(gòu)建了人結(jié)核桿菌休克蛋白65和Ag85A基因真核雙表達(dá)質(zhì)粒并在體外表達(dá)。李海燕，毛愛軍等（2004）將黑曲霉糖化酶和木聚糖酶基因在工業(yè)用釀酒酵母中共同表達(dá)，該研究是通過構(gòu)建黑曲霉糖化酶、木聚糖酶基因雙表達(dá)的酵母Yip型載體Pnew4,與G418抗性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，從而將糖化酶和木聚糖酶基因表達(dá)原件整合到多倍體酒精生產(chǎn)用酵母cerevisiae2.346染色體上，獲得整合型分泌表達(dá)這兩種酶的工業(yè)釀酒酵母工程菌株GX11。將植酸酶和中性內(nèi)切纖維素酶在畢赤酵母中共表達(dá)目前未見報道。
