基本信息
- 項目名稱：
- “川黃柏系列現(xiàn)代生物工程技術研究與示范”
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 本項目通過組織培養(yǎng)的研究，培育出快速繁殖的川黃柏組培苗；通過細胞懸浮培養(yǎng)的研究，篩選出生長速度快的細胞株，提供大量次生代謝產(chǎn)物含量高的培養(yǎng)物，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。多倍體誘導研究，培育出器官表現(xiàn)出巨型性、次生代謝產(chǎn)物含量增加、生態(tài)適應性和對逆境的抗耐性強的新品種。轉基因的研究，培養(yǎng)出有效藥用成分含量高、在無激素的培養(yǎng)基上瘋狂生長的毛狀根，為可持續(xù)性次生代謝物生產(chǎn)提供一條可靠和有效途徑。四川省是生物技術產(chǎn)業(yè)化示范省,正在實施“7+3”產(chǎn)業(yè)。即7個優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)和3個潛力產(chǎn)業(yè)。而中藥產(chǎn)業(yè)就是7個優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)之一，生物工程是3個潛力產(chǎn)業(yè)之一。所以用生物工程技術進行中藥產(chǎn)業(yè)開發(fā)是非常有意義。本項目采用一系列現(xiàn)代生物工程技術研究我國藥用植物川黃柏進行示范研究，通過將這一系列現(xiàn)代生物工程技術普及到其他藥用植物上。最終目標是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化。
- 詳細介紹：
- 1．立項背景： 川黃柏為蕓香科黃柏屬植物黃皮樹Phellodendron Chinese Schneid.的干燥樹皮。主產(chǎn)于四川、貴州等地。川黃柏為著名川產(chǎn)道地“三木”類藥材之一，為國家二類保護植物。川黃柏中含有小檗堿(berberine)、黃柏堿（phellodendrine）木蘭堿（magnoflorine）、掌葉防已堿（palmatine）、黃柏酮（obacunone）等。經(jīng)過近幾年的研發(fā)現(xiàn)川黃柏具有抗病原微生物、對消化系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的疾病具有療效作用的藥理作用。 國內(nèi)市場每年對川黃柏的需求量逐年增加。據(jù)對全國17家大型藥材市場及中藥材原料行業(yè)每年所需用川黃柏總量估算， 2000～2001年為1000～1200噸，2006年增加至3000～3200噸左右，2008年上升至3500～3800噸，至2009年更有望抬升到5000噸。但是，經(jīng)過多年砍伐剝皮，資源已經(jīng)不多。目前野生川黃柏資源已稀少,四川省主要分布在平武、茂縣、寶興、雅安、美姑、一線以東盆地邊緣山地。80年代,計劃經(jīng)濟向商品經(jīng)濟轉換,管理失控,盲目亂砍亂伐,野生資源破壞極為嚴重。其中大部分用于提取小蘗堿,許多幼樹亦遭厄運,資源受到毀滅性破壞.針對這一現(xiàn)象,野生黃柏列入國家保護品種,嚴禁再破壞野生資源;藥用必須栽培,砍伐剝皮需經(jīng)林管部門審批。目前川黃柏主要來源于人工大面積栽種黃皮樹.黃皮樹雌雄異株,留種困難,且采用有性繁殖,其種子變異率大,難以保證品種特性,而利用扦插繁殖，插條難生根，繁殖速度慢，并且川黃柏藥用樹皮時,主要是使用較厚的主干及枝干皮。為此,一般應采剝生長15年以上的樹皮。這種單純從大自然中提取原材料的做法不僅已遠遠不能滿足市場的需求，而且還破外了野生資源，使野生資源銳減。同時，在川黃柏種植過程中存在農(nóng)藥殘留、重金屬含量過高、質量不穩(wěn)定等問題嚴重影響藥材質量，在一定程度上阻礙了川黃柏的現(xiàn)代化研究。 本項目采用藥用植物組織培養(yǎng)、細胞懸浮培養(yǎng)、多倍體誘導和轉基因等一系列現(xiàn)代生物工程技術,旨在培育含有效藥用成分含量高、生長速度快、質量穩(wěn)定、綠色無污染、品質優(yōu)良、可排除病菌和蟲害的侵染等多種優(yōu)良性狀的川產(chǎn)道地藥材川黃柏新品種，從而解決川黃柏市場供需不平衡的問題，也解決了單純從大自然中提取川黃柏的做法，保護川黃柏的野生資源。本項目通過將這一系列現(xiàn)代生物工程技術應用到中藥材川黃柏示范研究上，其最終目的是為了讓這一系列現(xiàn)代生物工程技術普及到我國的其它藥用植物研究中去，以解決目前制約我國傳統(tǒng)中藥材實現(xiàn)現(xiàn)代化面臨的諸多問題。 中醫(yī)藥作為世界傳統(tǒng)醫(yī)藥寶庫中的一顆明珠,是迄今為止世界上保存得最為完整的民族醫(yī)藥體系,它以顯著的臨床療效、浩翰的醫(yī)療文獻屹立于世界醫(yī)療之林。幾千年來,我國民族醫(yī)藥為保障各族人民的身體健康做出了不可磨滅的貢獻。有專家預言,21世紀可能是中藥的世紀,天然藥物將會得到更快的發(fā)展。中國加入WTO后,中醫(yī)藥面臨著一次千載難逢的好機會, 中醫(yī)藥必將以其特有的優(yōu)勢為振興民族經(jīng)濟、弘揚民族文化發(fā)揮積極作用。據(jù)資料統(tǒng)計,目前的藥品中僅有1/4來自植物,絕大部分為人體不能代謝的化學合成物質。進入21世紀,藥用植物在保障人類健康的社會醫(yī)療事業(yè)中的作用越來越重要。為戰(zhàn)勝危及人類生命的癌癥、艾滋病、心臟病等嚴重疾病,人們正在不斷從植物中尋找新藥源,因為在藥用植物中包含著許多人們尚未認識和開發(fā)的具有新功能的結構,其中不少有望成為新的藥物。然而,許多有獨特生理活性的植物天然次生產(chǎn)物,在植物中的含量很低,利用微生物或化學方法不能或難以合成,并且受到資源和環(huán)境條件的限制,靠采集野生資源提取很難滿足需要,因此用生物工程技術來工業(yè)化生產(chǎn)這些中藥材，實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化勢在必行。生物工程技術的興起,為我國藥用植物的研究和發(fā)展提供了良機和手段。借助生物工程技術,可使瀕臨滅絕的藥用植物資源得以保存和繁殖,保持自然界生物的多樣性;將那些數(shù)量極少而又有價值的新類型化合物進行擴增,滿足臨床的需求。生物技術的廣泛應用,將徹底改變傳統(tǒng)藥用植物生產(chǎn)和加工技術,使之更適合新時代的要求。 2．詳細科學技術內(nèi)容： 本項目采用藥用植物組織培養(yǎng)、細胞懸浮培養(yǎng)、多倍體誘導、染色體核型分析和轉基因等一系列現(xiàn)代生物工程技術,旨在培育含有效藥用成分含量高、生長速度快、質量穩(wěn)定、綠色無污染、品質優(yōu)良、可排除病菌和蟲害的侵染等多種優(yōu)良性狀的川產(chǎn)道地藥材川黃柏新品種，從而為解決川黃柏市場資源短缺的問題，同時保護川黃柏的野生資源。通過將這一系列現(xiàn)代生物工程技術應用到中藥材川黃柏示范研究上，其最終目的可以將這一系列現(xiàn)代生物工程技術普及到我國的其它藥用植物，以解決目前我國傳統(tǒng)的中藥材面臨以下諸多問題。采用植物組織培養(yǎng)、細胞懸浮培養(yǎng)、多倍體誘導、染色體核型分析和轉基因等一系列生物工程技術發(fā)展中藥材生產(chǎn)。是積極響應四川省正在實施“7+3”產(chǎn)業(yè)。所以用生物工程技術進行中藥產(chǎn)業(yè)開發(fā)是非常有意義的。 圍繞項目總體目標，設置了10個研究專項。 （1）專項一：川黃柏愈傷組織誘導研究 在含有不同種類和不同濃度激素的培養(yǎng)基中誘導川黃柏愈傷組織，誘導出的愈傷組織為后續(xù)的實驗“川黃柏成熟葉片植株再生的研究”、“川黃柏的細胞懸浮培養(yǎng)”和“川黃柏愈傷組織多倍體誘導研究”奠定了基礎，同時也有利于今后通過組織培養(yǎng)直接從愈傷組織中提取小蘗堿。 （2）專項二：川黃柏成熟葉片植株再生的研究 首次建立了一套以川黃柏成熟葉片為外植體的植株再生的快速繁殖技術。研究出最佳誘導愈傷組織培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D4.0mg/L、MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D1.0mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D2.0mg/L，誘導率均為100%；不定芽誘導培養(yǎng)基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L；生根培養(yǎng)基MS+NAA0.3mg/L+IAA0.3mg/L。隨著中藥材市場國際化的推進，川黃柏在藥材和化妝品市場的大量應用，使得市場對川黃柏的需求量日益增加.本次研究建立的川黃柏成熟葉片植株再生的方式不僅能保持植株優(yōu)良性狀的穩(wěn)定，而且可以迅速擴大繁殖規(guī)模，在很短的時間內(nèi)為生產(chǎn)上提供大量優(yōu)質苗木，具有重大的經(jīng)濟價值；同時也為進一步用葉圓盤法對其進行轉基因研究創(chuàng)造了條件. （3）專項三：正交設計法在川黃柏組織培養(yǎng)中的應用 首次采用能夠大幅度減少試驗次數(shù)而且并不會降低試驗可行度的正交試驗法探索了4種外源激素對川黃柏誘導愈傷組織的影響, 結果顯示四種激素6-BA、2.4-D、IAA、NAA對川黃柏的愈傷組織有不同的影響，它們的作用大小可表示為2.4-D>6-BA>IAA>NAA. 川黃柏愈傷組織誘導最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+2.4-D1.0mg/L+IAA0.3mg/L. （4）專項四：川黃柏細胞懸浮培養(yǎng) 植物細胞懸浮培養(yǎng)技術是當今藥用植物實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的必經(jīng)之路，目前已在紅豆杉、甘草、人參和黃連等多種藥物的生產(chǎn)中取得了成功。通過不斷改善植物細胞體外培懸浮培養(yǎng)條件，可大大地提高生物細胞中次生代謝的含量，并且還可以通過向培養(yǎng)基中添加藥物合成的前體物質，經(jīng)培養(yǎng)將其轉化為目的化合物，以此來增加有效成分的含量；另外，對懸浮培養(yǎng)的細胞進行特定的生物遺傳轉化反應，也將獲得新的藥物成分，從而可很好地實現(xiàn)了天然植物大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)藥物的目的。在川黃柏細胞懸浮培養(yǎng),首先將在固體培養(yǎng)基上獲得的生長旺盛的、排列較疏松的川黃柏愈傷組織按一定數(shù)量轉入MS液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)3天后，依據(jù)細胞的生長狀況可確立獲得的第一代川黃柏細胞懸浮液。并對該細胞懸浮液進行細胞活力的測定和細胞密度計數(shù)。川黃柏細胞懸浮培養(yǎng)體系建立的技術參數(shù)確立 ：①用于細胞懸浮的基本培養(yǎng)基MS、B5、SH、White等的篩選； ②培養(yǎng)基中激素配比、接種量、光照條件、碳源、pH值等因素對培養(yǎng)細胞的生長速度和次生代謝物含量的影響研究； ③懸浮培養(yǎng)液中細胞重量的測定和生長曲線的繪制。 ④川黃柏中小檗堿的的提取、分離、純化和用高效液相色譜法（HPLC）測定含量 （5）專項五：川黃柏多倍體誘導研究 多倍體是高等植物染色體進化的顯著特征。多倍體特別是異源多倍體在染色體加倍后可帶來營養(yǎng)器官的巨大性變化,同時多倍體的基因劑量倍增,從而使植物的新陳代謝旺盛,其體內(nèi)的某些生化成分的含量也相應提高。另外,植物多倍體使植株基因活性及酶的差異性增強,從而加強了植株的生態(tài)適應力和對逆境的抗性,使其在生活力、對環(huán)境適應性,抗旱、抗寒及抗病蟲害等表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。川黃柏植物是重要的藥用植物，選育優(yōu)良的川黃柏植物品種是提高其藥材質量和產(chǎn)量的有效途徑。本項目首次采用秋水仙素對川黃柏莖段愈傷組織、種子和腋芽進行多倍體誘變處理。經(jīng)植物形態(tài)學和染色體數(shù)檢測, 誘導后的材料具有明顯的多倍體特征.因此采用秋水仙素對川黃柏不同部位進行多倍體誘導，是一種行之有效的生物技術方法。 （6）專項六：川黃柏染色體制作和核型分析研究 染色體核型分析是細胞遺傳學、染色體工程、現(xiàn)代分類學和進化理論的重要手段，也是一種簡便的方法。不同物種的染色體都有各自特定的形態(tài)結構（包括染色體的長度、著絲點位置、臂比、隨體大小等）特征，而且這種形態(tài)特征是相對穩(wěn)定的。因此，染色體核型分析是植物種質資源遺傳性研究的重要內(nèi)容。由于染色體長臂和短臂不一，就表現(xiàn)出著絲點位置不同。此外，在核型分析中，次縊痕或核仁組成區(qū)（NOR）和隨體（SAT）的數(shù)目、分布和大小的差異，常常成為區(qū)分某些近緣種或屬的主要特征，因此，它們識別與判斷極為重要。本文首次利用川黃柏新生的愈傷組織為實驗材料進行染色體制片，獲得了川黃柏染色體數(shù)目和核型分析資料，并為川黃柏的細胞遺傳學研究提供了理論依據(jù). （7）專項七：川黃柏毛狀根的誘導及活性成分的產(chǎn)生 毛狀根培養(yǎng)是20世紀80年代發(fā)展起來的基因工程和細胞工程相結合的一項技術,它是將發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質粒中含有的T-DNA整合到植物細胞的DNA上,誘導植物細胞產(chǎn)生毛狀根.如今,植物毛狀根培養(yǎng)被認為是獲得有用次生代謝產(chǎn)物的重要途徑.如何在培養(yǎng)過程中提高毛狀根中有用次生代謝產(chǎn)物的積累能力成為人們關注的焦點.毛狀根培養(yǎng)相對于細胞培養(yǎng)具有遺傳和生物化學方面的穩(wěn)定性,毛狀根可以在不含激素的培養(yǎng)基上快速生長并可以大量積累經(jīng)濟價值較高的次生代謝產(chǎn)物.因此,毛狀根被認為是極好的獲得植物次生代謝產(chǎn)物的原材料.近年來培養(yǎng)珍貴藥用植物毛狀根來獲取次生代謝產(chǎn)物成為國內(nèi)外研究的熱點.本實驗首次利用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834、A4、 R1600和R1000誘導川黃柏不同外植體產(chǎn)生毛狀根。經(jīng)PCR擴增實驗證實發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質粒的T-DNA片段已整合進入川黃柏植物核基因組中，HPLC測定結果顯示，川黃柏毛狀根培養(yǎng)物中含有鹽酸小檗堿，并且其含量高于川黃柏組培苗和愈傷組織。 （8）專項八：川黃柏高效遺傳轉化系統(tǒng)的建立和植株再生的研究 在研究川黃柏組培苗快繁方法和川黃柏毛狀根的誘導的基礎上,首次利用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601高頻轉化川黃柏帶子葉下胚軸,并將獲得的毛狀根置于含不同生長調(diào)節(jié)物質配比的培養(yǎng)基上誘導產(chǎn)生轉基因再生植株。建立了一套發(fā)根農(nóng)桿菌高頻轉化川黃柏的有效方法。 （9）專項九：川黃柏不同部位中鹽酸小檗堿的研究 川黃柏中主要含有小檗堿、黃柏堿和木蘭堿（magnoflorine）等,但主要以小檗堿為主。本實驗采用HPLC測定了由以上實驗所獲得的愈傷組織、懸浮細胞、多倍體植株、毛狀根和川黃柏植物的樹皮中鹽酸小檗堿的含量。結果顯示采用植物組織培養(yǎng)、細胞懸浮培養(yǎng)、多倍體誘導、染色體核型分析和轉基因等一系列現(xiàn)代生物工程技術,的確可以培育含有效藥用成分含量高和質量穩(wěn)定等多種優(yōu)良性狀的川產(chǎn)道地藥材川黃柏新品種。 （10）專項十:川黃柏離體培養(yǎng)和藥用成分的抑菌試驗研究 盡管川黃柏中主要有效抗菌成分是鹽酸小檗堿，但在川黃柏植物體中還含有巴馬亭、藥根堿、黃柏堿和黃柏酮等其他有效抗菌成分。本實驗根據(jù)中藥是多成分用藥原則，綜合研究了由以上實驗所獲得的愈傷組織、懸浮細胞、多倍體植株、毛狀根和川黃柏植物的樹皮中多種抗菌成分的聯(lián)合抗菌作用，從而真實客觀地反映愈傷組織、懸浮細胞、多倍體植株、毛狀根和川黃柏植物的樹皮中藥物的抑菌效力。結果顯示采用植物組織培養(yǎng)、細胞懸浮培養(yǎng)、多倍體誘導、染色體核型分析和轉基因等一系列現(xiàn)代生物工程技術,的確可以培育含有效藥用成分含量高、質量穩(wěn)定、綠色無污染、品質優(yōu)良、可排除病菌和蟲害的侵染等多種優(yōu)良性狀的川產(chǎn)道地藥材川黃柏新品種。 3．發(fā)現(xiàn)、發(fā)明及創(chuàng)新點： 1、報道川黃柏離體器官誘導愈傷組織的研究結果，為今后通過組織培養(yǎng)直接從愈傷組織中提取小蘗堿奠定基礎。 2、首次采用正交試驗法獲得了川黃柏葉片誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+IAA0.3mg/L。 3、首次建立了一套以川黃柏成熟葉片為外植體的植株再生的快速繁殖技術。研究出最佳誘導愈傷組織培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D4.0mg/L、MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D1.0mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D2.0mg/L，誘導率均為100%；不定芽誘導培養(yǎng)基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L；生根培養(yǎng)基MS+NAA0.3mg/L+IAA0.3mg/L。 4、以川黃柏的葉片、葉柄、莖段為外植體誘導出松散型白色愈傷組織,誘導愈傷的培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L+2.4-D2.0mg/L。將培養(yǎng)的愈傷組織進行繼代和懸浮培養(yǎng),經(jīng)兩代懸浮培養(yǎng)后，對第三代懸浮培養(yǎng)情況進行細胞生長曲線繪制，實驗結果表明為S型細胞生長曲線。同時將懸浮獲得的細胞產(chǎn)物經(jīng)HPLC測定確定其含有鹽酸小檗堿，故可確定產(chǎn)物中含有鹽酸小檗堿。 5、首次采用秋水仙素對川黃柏莖段愈傷組織、種子和腋芽進行多倍體誘導，成功獲得了具有明顯多倍體特征的川黃柏多倍體植株。 6、首次對川黃柏植物體細胞進行染色體核型分析研究。獲得了川黃柏核型公式為K(2n)=80=68m(2SAT)+6sm+6T。其中中部著絲點染色體（m）為34對，并有一對帶有隨體；近中部著絲點染色體（sm）為3對；端部著絲點染色體（T）為3對；川黃柏體細胞染色體數(shù)為2n=80。 7、首次利用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834、A4、 R1600和R1000對木本植物川黃柏進行了遺傳轉化研究，經(jīng)PCR擴增實驗證實發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質粒的T-DNA片段已整合進入川黃柏植物核基因組中，該實驗取得了成功。并用HPLC測定其鹽酸小檗堿含量，結果顯示川黃柏毛狀根培養(yǎng)物中含有鹽酸小檗堿，并且其含量高于川黃柏組培苗和愈傷組織。 8、建立了一套發(fā)根農(nóng)桿菌高頻轉化川黃柏的有效方法。利用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601高頻轉化川黃柏帶子葉下胚軸并獲得毛狀根，通過將川黃柏毛狀根轉入芽分化培養(yǎng)基(MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L)中對不定芽進行誘導，首次獲得了川黃柏轉基因植物。 9、在川黃柏遺傳轉化的脫菌實驗環(huán)節(jié)，首次提出采用配制的500 mg?L-1頭孢噻肟鈉脫菌水清洗產(chǎn)生了菌斑的轉化外植體，使轉化外植體成活率大大的提高，保證了遺傳轉化實驗的成功。 10、采用HPLC測定了川黃柏植物的樹皮、一年生幼葉和三年生老葉中鹽酸小檗堿的含量。結果表明：川黃柏樹皮、幼葉和老葉中都含有鹽酸小檗堿，其中樹皮含量為5.6%、一年生幼葉為0.33%、三年生以上老葉為0.52%. 11、本項目根據(jù)中藥多成分用藥原則，首次綜合研究了川黃柏植物體中多種抗菌成分的聯(lián)合抗菌作用，比較了川黃柏不同活性成分的抑菌效力大小，從而真實客觀地反映川黃柏藥物的抑菌效力，為進一步開發(fā)川黃柏藥物資源奠定了理論基礎。 4．與當前國內(nèi)外同類研究、同類技術的綜合比較： （1）整體技術達到國內(nèi)領先水平 該項目采用藥用植物組織培養(yǎng)、細胞懸浮培養(yǎng)、多倍體誘導和轉基因等一系列現(xiàn)代生物工程技術,培育出含有效藥用成分含量高、生長速度快、質量穩(wěn)定、綠色無污染、品質優(yōu)良、可排除病菌和蟲害的侵染等多種優(yōu)良性狀的川產(chǎn)道地藥材川黃柏新品種，從而為解決川黃柏市場資源短缺的問題，同時保護川黃柏的野生資源。通過將這一系列現(xiàn)代生物工程技術應用到中藥材川黃柏示范研究上，其最終目的可以將這一系列現(xiàn)代生物工程技術普及到我國的其它藥用植物。以解決目前我國傳統(tǒng)的中藥材面臨以下諸多問題。采用植物組織培養(yǎng)、細胞懸浮培養(yǎng)、多倍體誘導、染色體核型分析和轉基因等一系列生物工程技術發(fā)展中藥材生產(chǎn)。是積極響應四川省正在實施“7+3”產(chǎn)業(yè)。所以用生物工程技術進行中藥產(chǎn)業(yè)開發(fā)是非常有意義的。本項目10個專項內(nèi)容均達到國內(nèi)領先或先進水平，整體技術國內(nèi)領先。 （2）創(chuàng)新性強 國內(nèi)外目前對川黃柏的研究報道了川黃柏離體器官誘導愈傷組織，并且測定了鹽酸小 檗堿的含量。但是對于川黃柏的深層次研究尚未見到報道。本項目的創(chuàng)新性體現(xiàn)在以下8方 面： 1、首次采用正交試驗法獲得了川黃柏葉片誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+IAA0.3mg/L。 2、首次建立了一套以川黃柏成熟葉片為外植體的植株再生的快速繁殖技術。研究出最佳誘導愈傷組織培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D4.0mg/L、MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D1.0mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D2.0mg/L，誘導率均為100%；不定芽誘導培養(yǎng)基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L；生根培養(yǎng)基MS+NAA0.3mg/L+IAA0.3mg/L。 3、首次采用秋水仙素對川黃柏莖段愈傷組織、種子和腋芽進行多倍體誘導，成功獲得了具有 明顯多倍體特征的川黃柏多倍體植株。 4、首次對川黃柏植物體細胞進行染色體核型分析研究。獲得了川黃柏核型公式為K(2n)=80=68m(2SAT)+6sm+6T。其中中部著絲點染色體（m）為34對，并有一對帶有隨體；近中部著絲點染色體（sm）為3對；端部著絲點染色體（T）為3對；川黃柏體細胞染色體數(shù)為2n=80。 5、首次利用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834、A4、 R1600和R1000對木本植物川黃柏進行了遺傳轉化研究，經(jīng)PCR擴增實驗證實發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質粒的T-DNA片段已整合進入川黃柏植物核基因組中，該實驗取得了成功。并用HPLC測定其鹽酸小檗堿含量，結果顯示川黃柏毛狀根培養(yǎng)物中含有鹽酸小檗堿，并且其含量高于川黃柏組培苗和愈傷組織。 6、建立了一套發(fā)根農(nóng)桿菌高頻轉化川黃柏的有效方法。利用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601高頻轉化川黃柏帶子葉下胚軸并獲得毛狀根，通過將川黃柏毛狀根轉入芽分化培養(yǎng)基(MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L)中對不定芽進行誘導，首次獲得了川黃柏轉基因植物。 7、在川黃柏遺傳轉化的脫菌實驗環(huán)節(jié)，首次提出采用配制的500 mg?L-1頭孢噻肟鈉脫菌水清洗產(chǎn)生了菌斑的轉化外植體，使轉化外植體成活率大大的提高，保證了遺傳轉化實驗的成功。 8、本項目根據(jù)中藥多成分用藥原則，首次綜合研究了川黃柏植物體中多種抗菌成分的聯(lián)合抗菌作用，比較了川黃柏不同活性成分的抑菌效力大小，從而真實客觀地反映川黃柏藥物的抑菌效力，為進一步開發(fā)川黃柏藥物資源奠定了理論基礎。 （3）產(chǎn)業(yè)化程度高，經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益顯著 通過組織培養(yǎng)技術快速繁殖可脫除無性繁殖川黃柏植物體內(nèi)的病毒，獲得并保存無病毒川黃柏種苗。脫毒使川黃柏品種復壯，提高產(chǎn)量，改進品質。解決川黃柏植株雌雄異株而留種困難、采用有性繁殖其種子變異率大而難以保證品種特性、利用扦插繁殖但插條難生根和繁殖速度慢等問題。通過組織培養(yǎng)技術可以加快川黃柏植株繁殖系數(shù)，快速繁殖川黃柏種苗，經(jīng)濟、安全地保存川黃柏植物種質資源。用組織培養(yǎng)技術保存植物種質資源不受氣候、土壤、病蟲害影響，節(jié)省土地和人力資源。 項目中的細胞懸浮培養(yǎng)技術，對川黃柏離體器官進行誘導愈傷組織，通過激素的調(diào)節(jié)，誘導出生長旺盛的、排列較疏松的適合于細胞懸浮培養(yǎng)的愈傷組織，然后對愈傷組織進行懸浮培養(yǎng)，建立川黃柏的細胞懸浮培養(yǎng)體系。藥用植物細胞懸浮培養(yǎng)技術是當今藥用植物實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的必經(jīng)之路。通過不斷改善植物細胞體外培懸浮培養(yǎng)條件，可大大地提高生物細胞中次生代謝的含量，并且還可以通過向培養(yǎng)基中添加藥物合成的前體物質，經(jīng)培養(yǎng)將其轉化為目的化合物，以此來增加有效成分的含量；另外，對懸浮培養(yǎng)的細胞進行特定的生物遺傳轉化反應，也將獲得新的藥物成分，從而可很好地實現(xiàn)了天然植物大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)藥物的目的。 本項目中的多倍體誘導技術，主要是采用化學試劑秋水仙素對川黃柏的外植體進行處理，從而誘導多倍體的川黃柏。多倍體是高等植物染色體進化的顯著特征。多倍體特別是異源多倍體在染色體加倍后可帶來營養(yǎng)器官的巨大性變化,同時多倍體的基因劑量倍增,從而使植物的新陳代謝旺盛,其體內(nèi)的某些生化成分的含量也相應提高。另外,植物多倍體使植株基因活性及酶的差異性增強,從而加強了植株的生態(tài)適應力和對逆境的抗性,使其在生活力、對環(huán)境適應性,抗旱、抗寒及抗病蟲害等表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。 本項目中的藥用植物植物轉基因技術，是通過采用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834、A4、R1000、R1600、R1601誘導川黃柏的外植體產(chǎn)生毛狀根,再對毛狀根進行增殖培養(yǎng). 藥用植物轉基因技術是通過將發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質粒中含有的T-DNA整合到植物細胞的DNA上,誘導植物細胞產(chǎn)生毛狀根.對誘導產(chǎn)生的毛狀根進行培養(yǎng)與增殖的技術.毛狀根培養(yǎng)與增值技術是20世紀80年代發(fā)展起來的基因工程和細胞工程相結合的一項技術.如今,植物毛狀根培養(yǎng)被認為是獲得有用次生代謝產(chǎn)物的重要途徑.如何在培養(yǎng)過程中提高毛狀根中有用次生代謝產(chǎn)物的積累能力成為人們關注的焦點.毛狀根培養(yǎng)相對于細胞培養(yǎng)具有遺傳和生物化學方面的穩(wěn)定性,毛狀根可以在不含激素的培養(yǎng)基上快速生長并可以大量積累經(jīng)濟價值較高的次生代謝產(chǎn)物.因此,毛狀根被認為是極好的獲得植物次生代謝產(chǎn)物的原材料.近年來培養(yǎng)珍貴藥用植物毛狀根來獲取次生代謝產(chǎn)物成為國內(nèi)外研究的熱點.利用毛狀根培養(yǎng)來生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物,其生長迅速,分支多,次生代謝產(chǎn)物含量高,不需要外源激素,而且比細胞培養(yǎng)容易放大.研究發(fā)現(xiàn),在毛狀根培養(yǎng)過程中,改變培養(yǎng)條件或利用相關生物技術手段能夠提高毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的積累.改變培養(yǎng)條件主要分為改變化學條件和物理條件兩大類.化學條件的改變一般都是對培養(yǎng)基中的培養(yǎng)成分進行改變,比如添加激素,或者對培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分種類、配比進行調(diào)節(jié)等等;物理條件的改變一般是改變光的照射時間或者光的顏色以及培養(yǎng)溫度等條件.生物反應器就是將化學條件和物理條件融為一體而設計出來的次生代謝產(chǎn)物高產(chǎn)的一種裝置,針對不同的植物的毛狀根,生物反應器的大小、形狀以及設計原理等對其次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)出都有很大的影響.此外,針對不同植物毛狀根,通過添加誘導子、飼喂前體化合物以及應用反義技術等生物技術手段也可以大大提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。 6．應用情況： 從2002年起，通過查閱相關文獻，走訪調(diào)查等方式，全面調(diào)查了川黃柏相關情況。國內(nèi)市場每年對黃柏的需求量逐年增加。據(jù)對全國17家大型藥材市場及中藥材原料行業(yè)每年所需用的黃柏總量估算，進入21世紀后，需求量銳增，2000～2001年為1000～1200噸，2006年增加至3000～3200噸左右，2008年上升至3500～3800噸，至2009年更有望抬升到5000噸。但是，經(jīng)過多年砍伐剝皮，資源已經(jīng)不多。 80年代,計劃經(jīng)濟向商品經(jīng)濟轉換,管理失控,盲目亂砍亂伐,野生資源破壞極為嚴重。其中大部分用于提取小蘗堿,許多幼樹亦遭厄運,資源受到毀滅性破壞.目前川黃柏主要來源于人工大面積栽種黃皮樹.黃皮樹雌雄異株,留種困難,且采用有性繁殖,其種子變異率大,難以保證品種特性,而利用扦插繁殖，插條難生根，繁殖速度慢，并且川黃柏藥用樹皮時,不包括細枝皮和根皮,而是使用較厚的主干及枝干皮。為此,一般應采剝生長15年以上的樹皮。這種單純從大自然中提取原材料的做法不僅已遠遠不能滿足市場的需求，而且還破外了野生資源，使野生資源銳減。同時，在種植過程中，川黃柏中存在農(nóng)藥殘留、重金屬含量過高、質量不穩(wěn)定等問題嚴重影響了藥材質量，阻礙了中藥川黃柏現(xiàn)代化的研究。 項目采用藥用植物組織培養(yǎng)、細胞懸浮培養(yǎng)、多倍體誘導和轉基因等一系列現(xiàn)代生物工程技術,培育出了含有效藥用成分含量高、生長速度快、質量穩(wěn)定、綠色無污染、品質優(yōu)良、可排除病菌和蟲害的侵染等多種優(yōu)良性狀的川產(chǎn)道地藥材川黃柏新品種，為解決川黃柏市場資源短缺奠定了基礎。同時保護川黃柏的野生資源。通過將這一系列現(xiàn)代生物工程技術應用到中藥材川黃柏示范研究上，已經(jīng)成功地應用到了一些其他的藥用植物上，譬如，杜仲，菘藍，川貝母，喜樹等，培育出了含有多種優(yōu)良性狀的藥用植物新品種。 本項目通過組織培養(yǎng)技術快速繁殖得到大量的無病毒川黃柏種苗，在很短的時間內(nèi)為成都市都江堰的農(nóng)民提供了很多的無病毒種苗，具有重大的經(jīng)濟價值。本項目通過細胞懸浮培養(yǎng)和轉基因技術分別獲得了大量川黃柏細胞懸浮液和生長迅速的毛狀根，將大量川黃柏細胞懸浮液和生長迅速的毛狀根培養(yǎng)于發(fā)酵罐，結果效果顯著，得到了大量的培養(yǎng)物。本實驗通過多倍體誘導技術，獲得了大量的多倍體川黃柏植株，通過煉苗后，將大量的川黃柏植株移栽于試驗田中，目前長勢良好。 作為川黃柏藥用樹皮時，一般是剝?nèi)∩L15年以上的樹皮，并且經(jīng)砍伐后的川黃柏植株又不能再生，而采用藥用植物組織培養(yǎng)、細胞懸浮培養(yǎng)、多倍體誘導和轉基因等一系列現(xiàn)代生物工程技術培育出的川黃柏新品種，生長周期短，大約在2個月之內(nèi)可以完成一個周期。因此在15年之內(nèi)，可以完成90個生長周期。經(jīng)過測定川黃柏樹皮中小檗堿含量為5.6%，而組培苗和毛狀根中小檗堿的含量分別1.231%、1.346%，因此，在完成90個生長周期內(nèi)，其產(chǎn)量是大幅度地上升。并且采用生物工程技術，培養(yǎng)條件可以人為控制和調(diào)節(jié)，四季均可生產(chǎn)，不受地區(qū)、惡劣氣候、季節(jié)、黑夜及有害生物的影響，并且生長條件均一，占地面積少，在有限的時間和空間里便于工廠化生產(chǎn)，可對細胞生長自動控制和代謝過程合理調(diào)節(jié)，個體差異小，生產(chǎn)周期短，設備簡單，能節(jié)省人力、物力等。 成果轉化、推廣或產(chǎn)業(yè)化方面還需要幫助解決的問題 通過將一系列現(xiàn)代生物工程技術應用到中藥材川黃柏示范研究上，其最終目的是將這一系列現(xiàn)代生物工程技術普及到我國的其它藥用植物，但由于資金上的短缺，并不能夠在短期內(nèi)將這一系列技術更好地普及到我國其他藥用植物上。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 本項目采用藥用植物組織培養(yǎng)、細胞懸浮培養(yǎng)、多倍體誘導和轉基因等一系列現(xiàn)代生物工程技術,旨在培育含有效藥用成分含量高、生長速度快、質量穩(wěn)定、綠色無污染、品質優(yōu)良、可排除病菌和蟲害的侵染等多種優(yōu)良性狀的川黃柏新品種，解決川黃柏市場資源短缺的問題，保護野生資源。通過川黃柏示范研究，最終目的是將這一系列現(xiàn)代生物工程技術普及到我國的其它藥用植物，以解決目前制約我國傳統(tǒng)中藥材實現(xiàn)現(xiàn)代化面臨的諸多問題。
科學性、先進性及獨特之處
- （1）整體技術達到國內(nèi)領先水平：該項目采用藥用植物組織培養(yǎng)、細胞懸浮培養(yǎng)、多倍體誘導和轉基因等一系列現(xiàn)代生物工程技術,培育出含有效藥用成分含量高、生長速度快、質量穩(wěn)定、綠色無污染、品質優(yōu)良、可排除病菌和蟲害的侵染等多種優(yōu)良性狀的川產(chǎn)道地藥材川黃柏新品種。 （2）創(chuàng)新性強：本項目的創(chuàng)新性體現(xiàn)在8個方面。 （3）產(chǎn)業(yè)化程度高，經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益顯著。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 本項目通過組織培養(yǎng)的研究，培育出快速繁殖的川黃柏組培苗；通過細胞懸浮培養(yǎng)的研究，篩選出生長速度快的細胞株，提供大量次生代謝產(chǎn)物含量高的培養(yǎng)物，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。多倍體誘導研究，培育出器官表現(xiàn)出巨型性、次生代謝產(chǎn)物含量增加、生態(tài)適應性和對逆境的抗耐性強的新品種。轉基因的研究，培養(yǎng)出有效藥用成分含量高、在無激素的培養(yǎng)基上瘋狂生長的毛狀根，為可持續(xù)性次生代謝物生產(chǎn)提供一條可靠和有效途徑。
學術論文摘要
- 本項目采用藥用植物組織培養(yǎng)、細胞懸浮培養(yǎng)、多倍體誘導和轉基因等一系列現(xiàn)代生物工程技術,旨在培育含有效藥用成分含量高、生長速度快、質量穩(wěn)定、綠色無污染、品質優(yōu)良、可排除病菌和蟲害的侵染等多種優(yōu)良性狀的川產(chǎn)道地藥材川黃柏新品種，從而為解決川黃柏市場資源短缺的問題，同時保護川黃柏的野生資源。通過將這一系列現(xiàn)代生物工程技術應用到中藥材川黃柏示范研究上，其最終目的可以將這一系列現(xiàn)代生物工程技術普及到我國的其它藥用植物，以解決目前我國傳統(tǒng)的中藥材面臨制約了中藥材的中藥現(xiàn)代化的研究諸多問題。中藥現(xiàn)代化不僅是一場傳統(tǒng)中藥的新技術革命，更是一次現(xiàn)代中藥的新文化運動。積極采用藥用植物組織培養(yǎng)、細胞懸浮培養(yǎng)、多倍體誘導和轉基因等一系列生物工程技術發(fā)展中藥材生產(chǎn)。將生物工程技術進行中藥產(chǎn)業(yè)開發(fā)是非常有意義的。本項目通過川黃柏的示范研究，將這一系列現(xiàn)代生物工程技術普及到我國其他藥用植物之上，最終目標是實現(xiàn)我國中藥現(xiàn)代化，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥資源中篩選、深度開發(fā)達到現(xiàn)代國際質量標準的天然藥物,這是我國醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)自主創(chuàng)新的優(yōu)選開發(fā)途徑,也是中醫(yī)藥走向世界的必經(jīng)之路。
獲獎情況
- （1）該作品獲得第十屆“挑戰(zhàn)杯”四川省大學生課外學術科技作品競賽一等獎。 （2）該項目共發(fā)表系列研究論文9篇；其中《川黃柏高效遺傳轉化系統(tǒng)的建立和植株再生的研究》、《川黃柏多倍體誘導研究》和《川黃柏染色體制作和核型分析研究》論文被國際著名檢索機構CA收錄。目前已完成發(fā)明專利2項。
鑒定結果
- 首次建立以川黃柏葉片的快速繁殖技術；首次采用秋水仙素對川黃柏進行多倍體誘導；首次進行染色體核型分析研究；首次利用發(fā)根農(nóng)桿菌對川黃柏進行了遺傳轉化研究；首次研究了川黃柏中多種抗菌成分的聯(lián)合抗菌作用。
參考文獻
- 1、愈傷組織誘導 2、成熟葉片植株再生 3、正交設計法在組織培養(yǎng)中的應用 4、細胞懸浮培養(yǎng) 5、多倍體誘導研究 6、染色體制作和核型分析 7、毛狀根的誘導及活性成分的產(chǎn)生 8、高效遺傳轉化系統(tǒng)的建立和植株再生 9、離體培養(yǎng)和藥用成分的抑菌試驗 10、轉基因技術
同類課題研究水平概述
- 創(chuàng)新性強 本項目的創(chuàng)新性體現(xiàn)在以下8方面： 1、首次采用正交試驗法獲得了川黃柏葉片誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+IAA0.3mg/L。 2、首次建立了一套以川黃柏成熟葉片為外植體的植株再生的快速繁殖技術。研究出最佳誘導愈傷組織培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D4.0mg/L、MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D1.0mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D2.0mg/L，誘導率均為100%；不定芽誘導培養(yǎng)基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L；生根培養(yǎng)基MS+NAA0.3mg/L+IAA0.3mg/L。 3、首次采用秋水仙素對川黃柏莖段愈傷組織、種子和腋芽進行多倍體誘導，成功獲得了具有 明顯多倍體特征的川黃柏多倍體植株。 4、首次對川黃柏植物體細胞進行染色體核型分析研究。獲得了川黃柏核型公式為K(2n)=80=68m(2SAT)+6sm+6T。其中中部著絲點染色體（m）為34對，并有一對帶有隨體；近中部著絲點染色體（sm）為3對；端部著絲點染色體（T）為3對；川黃柏體細胞染色體數(shù)為2n=80。 5、首次利用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834、A4、 R1600和R1000對木本植物川黃柏進行了遺傳轉化研究，經(jīng)PCR擴增實驗證實發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質粒的T-DNA片段已整合進入川黃柏植物核基因組中，該實驗取得了成功。并用HPLC測定其鹽酸小檗堿含量，結果顯示川黃柏毛狀根培養(yǎng)物中含有鹽酸小檗堿，并且其含量高于川黃柏組培苗和愈傷組織。 6、建立了一套發(fā)根農(nóng)桿菌高頻轉化川黃柏的有效方法。利用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601高頻轉化川黃柏帶子葉下胚軸并獲得毛狀根，通過將川黃柏毛狀根轉入芽分化培養(yǎng)基(MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L)中對不定芽進行誘導，首次獲得了川黃柏轉基因植物。 7、在川黃柏遺傳轉化的脫菌實驗環(huán)節(jié)，首次提出采用配制的500 mg?L-1頭孢噻肟鈉脫菌水清洗產(chǎn)生了菌斑的轉化外植體，使轉化外植體成活率大大的提高，保證了遺傳轉化實驗的成功。 8、本項目根據(jù)中藥多成分用藥原則，首次綜合研究了川黃柏植物體中多種抗菌成分的聯(lián)合抗菌作用，比較了川黃柏不同活性成分的抑菌效力大小，從而真實客觀地反映川黃柏藥物的抑菌效力，為進一步開發(fā)川黃柏藥物資源奠定了理論基礎。
