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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- H9亞型禽流感病毒快速診斷技術(shù)研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 禽流感是禽類烈性傳染病之一，家禽在感染H9亞型禽流感病毒，特別當(dāng)伴有混合感染時(shí)，可導(dǎo)致并引起高死亡率及產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降。給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。本作品通過建立RT-LAMP反應(yīng)體系、結(jié)果可視化技術(shù)研究及臨床應(yīng)用等試驗(yàn)，成功地建立了一種H9亞型禽流感病毒的快速檢測(cè)方法，極大地所淡了診斷耗時(shí)，為該病的早期診斷提供了便利。該方法具有靈敏、簡(jiǎn)單、快速、直觀，無需復(fù)雜儀器的特點(diǎn)，合適在基層獸醫(yī)中推廣應(yīng)用。
- 詳細(xì)介紹：
- 禽流感是禽類烈性傳染病之一，家禽在感染H9亞型禽流感病毒，特別當(dāng)伴有混合感染時(shí)，可導(dǎo)致并引起高死亡率及產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降。給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。本作品通過建立RT-LAMP反應(yīng)體系、結(jié)果可視化技術(shù)研究及臨床應(yīng)用等試驗(yàn)，成功地建立了一種H9亞型禽流感病毒的快速檢測(cè)方法，極大地所淡了診斷耗時(shí)，為該病的早期診斷提供了便利。該方法具有靈敏、簡(jiǎn)單、快速、直觀，無需復(fù)雜儀器的特點(diǎn)，合適在基層獸醫(yī)中推廣應(yīng)用。 本作品經(jīng)敏感性試驗(yàn)，確定RT-LAMP方法比RT-PCR方法敏感性的10倍。兩種方法均有很好的特異性。針對(duì)109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子的檢測(cè)結(jié)果表明，RT-LAMP方法檢出率明顯高于PCR方法。 與傳統(tǒng)RT-PCR方法相比，本作品中使用的RT-LAMP方法不僅具有高敏感性，更為重要的是該方法可極大的節(jié)約檢測(cè)耗時(shí)。傳統(tǒng)RT-PCR需要將樣本RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后再應(yīng)用于檢測(cè)，即使在近年使用較多的一步法RT-PCR，也需在反應(yīng)初期進(jìn)行約30分鐘的反轉(zhuǎn)錄步驟。而RT-LAMP只需在反應(yīng)體系中加入反轉(zhuǎn)錄酶，即可在等溫條件下一步實(shí)現(xiàn)樣本RNA擴(kuò)增，總反應(yīng)僅耗時(shí)60分鐘，較RT-PCR方法節(jié)省至少90分鐘。 RT-LAMP檢測(cè)結(jié)果的判定方法主要分為四類，一是利用凝膠電泳觀察“梯形”條帶的生成，二是使用實(shí)時(shí)濁度儀進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，三是肉眼觀察反應(yīng)管內(nèi)是否產(chǎn)生白色渾濁，四是應(yīng)用熒光顯色劑顯色進(jìn)行判定。但前兩種方法需要特殊試劑與儀器設(shè)備，而利用肉眼觀察渾濁度則存在反應(yīng)管透明度及人為因素等影響結(jié)果的判定。目前有較多的RT-LAMP反應(yīng)使用SYBR Green I 染色劑作為熒光顯色劑，但該熒光顯色劑必須在反應(yīng)結(jié)束后打開反應(yīng)管加入，因而易造成核酸氣溶膠污染，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 本作品中使用鈣黃綠素與錳離子的混合溶液作為熒光指示劑，可通過觀察顏色變化直接判定反應(yīng)結(jié)果。另外，由于整個(gè)反應(yīng)過程和檢視過程中不需要開蓋，較好地避免了因氣溶膠污染而引起假陽性結(jié)果。 除上述內(nèi)容外，本作品還有很大的發(fā)展空間，使其更易于基層使用。例如在此基礎(chǔ)之上，使用FTA卡或沸水浴方法快速提取H9亞型禽流感病毒核酸，可節(jié)省樣本前處理時(shí)間2-3小時(shí)，并且無需有毒有害試劑與低溫高速離心機(jī)等儀器，操作簡(jiǎn)單。另外，還可對(duì)反應(yīng)試劑的組成與貯存條件進(jìn)行探究?jī)?yōu)化，建立一套較為完善簡(jiǎn)易的H9亞型禽流感診斷試劑盒，推廣至技術(shù)、條件相對(duì)落后的基層實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖場(chǎng)使用。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 禽流感是養(yǎng)禽業(yè)重要傳染病之一，H9亞型禽流感可導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率。仔雞易感染造成死亡，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率明顯下降，造成經(jīng)濟(jì)損失。項(xiàng)目組期望建立一種能夠快速、精確、簡(jiǎn)便，適合基層應(yīng)用的用于該病的快速診斷方法。 Notomi等發(fā)明了一種新的核酸擴(kuò)增方法。該方法可在等溫條件下高效擴(kuò)增靶基因，擁有較高的敏感性及特異性。此外，只需簡(jiǎn)單的恒溫設(shè)備即可進(jìn)行檢測(cè)，加之簡(jiǎn)便的可視化技術(shù)使其適合基層推廣應(yīng)用。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 1、使用含有6條引物的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法對(duì)H9亞型禽流感病毒進(jìn)行檢測(cè)，恒溫?cái)U(kuò)增，無需反轉(zhuǎn)錄過程，一步反應(yīng)即可。檢測(cè)耗時(shí)僅需60分鐘，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，節(jié)省大量檢測(cè)耗時(shí)。 2、在檢測(cè)反應(yīng)液中直接加入熒光顯色劑進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，或者根據(jù)反應(yīng)液顏色的變化判定反應(yīng)與否，簡(jiǎn)單直觀。 3、操作簡(jiǎn)單，快速簡(jiǎn)便，成本較低，適合基層推廣應(yīng)用。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 中國(guó)大陸自94年首次分離到H9亞型禽流感病毒后，該病開始廣泛流行，導(dǎo)致高死亡率及產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失。并有關(guān)于人感染該病毒的報(bào)道。早期診斷是疫病防控的關(guān)鍵，因此如能針對(duì)發(fā)病禽類進(jìn)行快速診斷，及時(shí)切斷傳染源，就顯得尤為重要。 本作品建立的診斷方法，不僅具有靈敏、簡(jiǎn)單、快速、直觀，無需復(fù)雜儀器的特點(diǎn)，而且檢測(cè)成本較低。此外，若配合簡(jiǎn)化的樣本處理方法，將會(huì)更加適合在基層獸醫(yī)中推廣應(yīng)用。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 利用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP），建立了一種特異、靈敏、便捷，H9亞型禽流感病毒的檢測(cè)方法。該方法使用6條特異引物，在63℃的等溫條件下進(jìn)行反應(yīng)，敏感性是RT-PCR方法的10倍。通過對(duì)15種H亞型禽流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒的檢測(cè)表明，該方法具有良好的特異性。在反應(yīng)體系中使用鈣黃綠素與錳離子的混合溶液作為熒光指示劑可以用于RT-LAMP結(jié)果判定。對(duì)109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)表明，RT-LAMP方法陽性檢出率高于RT-PCR。 通過該研究，我們獲得了一套較為完整的針對(duì)H9亞型禽流感病毒的檢測(cè)方法，具有靈敏、簡(jiǎn)單、快速、直觀的特點(diǎn)。成本較低，適合基層推廣應(yīng)用，并有助于該病的早期診斷，便于該病防控。
獲獎(jiǎng)情況
- 1、“H9亞型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立與熒光顯色劑的應(yīng)用”一文，已于2010年6月被中國(guó)科技核心期刊《農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)》接受，并于2011年第19卷第1期發(fā)表。 2、“H9亞型禽流感病毒快速診斷技術(shù)研究”做為全國(guó)91個(gè)參展項(xiàng)目之一，參加了2010年9月25日由教育部高教司主辦，大連理工大學(xué)承辦的“第三屆全國(guó)大學(xué)生創(chuàng)新論壇”。
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- 1、LAMP技術(shù)及其在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用，鞠慧萍等，上海畜牧獸醫(yī)通訊,2010 2、熒光顯色在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的應(yīng)用，張躍偉等，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2010 3、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)的應(yīng)用研究，劉永生等，中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010 4、豬胸膜肺炎放線桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用，李佳禾等，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009 5、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在動(dòng)物病原檢測(cè)中的應(yīng)用，何玲等，廣東畜牧獸醫(yī)科技,2009 6、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在畜禽疾病診斷中的應(yīng)用，劉寶山等，中國(guó)獸醫(yī)雜志,2009
同類課題研究水平概述
- 1、目前國(guó)內(nèi)外大量研究均使用SYBR Green I 染色劑作為熒光顯色劑應(yīng)用于LAMP方法檢測(cè)，但該方法存在操作復(fù)雜，易造成核酸產(chǎn)物污染的缺點(diǎn)，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究使用鈣黃綠素與錳離子的混合溶液作為結(jié)果指示劑，僅需在反應(yīng)前加入試劑，通過反應(yīng)后觀察顏色變化即可判定檢測(cè)結(jié)果，有效的避免了上述問題。 2、除本作品完成人在中國(guó)科技核心期刊《農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)》發(fā)表的一篇論文外，國(guó)內(nèi)目前未見相關(guān)研究報(bào)道，該方法在H9禽流感病毒診斷方面還未開始應(yīng)用。 3、針對(duì)H9亞型禽流感病毒，目前國(guó)外僅見一篇英文文獻(xiàn)報(bào)道——Development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of H9 avian influenza virus。該文獻(xiàn)中使用4條引物進(jìn)行反應(yīng)，且不包含熒光指示劑的應(yīng)用，診斷過程復(fù)雜繁瑣。而本研究使用6條引物進(jìn)行反應(yīng)，可大大提高反應(yīng)效率；加上顯色劑的應(yīng)用，是檢測(cè)結(jié)果肉眼可見，極大的縮短了檢測(cè)耗時(shí)。 4、與目前使用較多的PCR方法相比，該方法省去了單獨(dú)的反轉(zhuǎn)錄過程，且恒溫反應(yīng)，操作簡(jiǎn)便，無需復(fù)雜昂貴的設(shè)備，同時(shí)保證了方法的特異性與敏感性。 5、綜上所述，該方法靈敏、簡(jiǎn)單、快速、直觀，適合基層推廣應(yīng)用，并有助于該病的早期診斷，便于該病防控。
