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基本信息

項(xiàng)目名稱：
新型可重復(fù)使用質(zhì)粒提取試劑盒
小類：
能源化工
簡介：
該試劑盒包括質(zhì)粒純化柱、質(zhì)粒純化柱配有的系列溶液和菌體裂解液。本項(xiàng)目采用由聚合物形成的整體床型質(zhì)粒純化柱與該質(zhì)粒純化柱配備的系列溶液提取質(zhì)粒。整體床型質(zhì)粒純化柱制備簡單、傳質(zhì)性能好、耐污染能力強(qiáng)、質(zhì)粒提取過程方便快捷，且多次提取質(zhì)粒樣品而純化柱性能無明顯改變。本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有質(zhì)粒提取試劑盒成本高、質(zhì)粒提取純化柱制備復(fù)雜、材料傳質(zhì)性能差、利用率有限、容量低、價格昂貴以及無法重復(fù)使用的缺陷。
詳細(xì)介紹：
基因治療的研究和基因疫苗的開發(fā)被認(rèn)為是人類醫(yī)學(xué)史上的兩大突破?；蛑委熅褪菍⒂兄委焹r值的基因構(gòu)建到特定的載體中，再導(dǎo)入到人的體細(xì)胞中，糾正人體自身基因結(jié)構(gòu)或功能上的紊亂，或抑制外源致病遺傳物質(zhì)的復(fù)制，達(dá)到治療的目的。DNA疫苗也是通過將抗原基因?qū)氲饺梭w細(xì)胞中，在抗原侵犯時能產(chǎn)生能夠抵制抗原的抗體，而達(dá)到預(yù)防疾病的目的。DNA疫苗因其具有能夠有效誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)、技術(shù)通用性強(qiáng)、研發(fā)周期短、生產(chǎn)和運(yùn)輸成本低等優(yōu)點(diǎn),在病毒性、細(xì)菌性、寄生蟲疾病、腫瘤和變態(tài)免疫反應(yīng)的預(yù)防和治療等領(lǐng)域顯示了良好的應(yīng)用前景,被稱為“第三代疫苗”。 有效的基因治療必須先把治療核酸高效地傳遞到靶細(xì)胞中，根據(jù)基因?qū)胼d體的不同，目前的基因治療分為病毒載體和非病毒載體兩種。病毒性載體的基因治療通常采用改造過的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒等。由于病毒性載體的毒性和抗原性，其使用可能激活腫瘤基因或使腫瘤抑制基因失活，因此利用病毒性載體會引起安全和免疫調(diào)節(jié)方面的擔(dān)憂，在目前的報道中，發(fā)現(xiàn)6起死亡事件，都是在使用病毒載體之后得了突發(fā)性疾病而死。 質(zhì)粒是染色體外可以進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳元件，廣泛存在于各類生物體的細(xì)胞中。質(zhì)粒是非病毒載體中最有前途的一種。當(dāng)質(zhì)粒內(nèi)插入具有治療作用的目的基因及所有的調(diào)控元件，即有可以用于哺乳細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒相對于病毒性載體，具有低免疫反應(yīng)、安全穩(wěn)定、低成本、適合工業(yè)生產(chǎn)等優(yōu)勢。 近年來，隨著基因治療和DNA 疫苗在癌癥、單基因遺傳病、艾滋病、心血管疾病、關(guān)節(jié)炎等重大疾病的診斷和治療方面顯示了突出的優(yōu)勢，質(zhì)粒逐漸成為基因治療的最重要的基因傳遞系統(tǒng)，應(yīng)用于基因治療的藥用質(zhì)粒的提取技術(shù)的發(fā)展目前已成為該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)之一。這進(jìn)一步促進(jìn)了高純度質(zhì)粒提目前常見的質(zhì)粒提取方法有SDS堿裂解法，煮沸法，酚仿有機(jī)抽提法，層析法，沉淀法等。然而這些經(jīng)典的技術(shù)不是快速的，它們需要作若干步操作和材料與試劑的轉(zhuǎn)移，這些不容易做到自動化，也不適合用于純化藥用質(zhì)粒。此外，酚、氯仿等有機(jī)溶劑易造成環(huán)境污染，有損操作者的健康。 質(zhì)粒提取試劑盒因操作方便、提取效率較高成為質(zhì)粒提取最常用的方法。20世界90年代以來，商品化的質(zhì)粒提取試劑盒已經(jīng)非常普遍。試劑盒通常采用堿裂解結(jié)合質(zhì)粒純化柱分離純化的方法提取質(zhì)粒。試劑盒的主要生產(chǎn)廠家有Qiagen、Promega、Life Technologies、Stratagene和Nest Group等國外公司，以及Tiangen和博大等國內(nèi)公司。目前試劑盒中選用的質(zhì)粒純化柱材料通常為硅膠，其分離原理是利用質(zhì)粒與硅膠的吸附作用純化質(zhì)粒，相互作用依賴于DNA的堿基組成和拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)，但該材料的吸附性能會受到片段長度的影響。一般硅膠材料會制成球形，制備過程中除了包括球形粒子制備步驟外，還需要篩分粒徑適應(yīng)的粒子，同時還會受到柱裝填技術(shù)的影響。而質(zhì)粒吸附材料一般采用堿再生，而常用的硅膠型吸附材料由于在堿性環(huán)境下會溶解，而難以重復(fù)使用。目前使用的高純度質(zhì)粒純化柱主要是國外公司出產(chǎn)的Qiagen等進(jìn)口試劑盒，質(zhì)粒提取成本非常高。 針對目前質(zhì)粒提取試劑盒成本高、質(zhì)粒提取純化柱制備復(fù)雜、材料傳質(zhì)性能差、利用率有限、容量低，通常采用的硅膠材料無法重復(fù)使用，而且該產(chǎn)品主要依靠進(jìn)口，價格昂貴。本項(xiàng)目目的是提供一種提取質(zhì)粒純度高、可重復(fù)使用的大幅度降低質(zhì)粒純化操作成本的試劑盒。 將含有環(huán)氧端基的甲基丙烯酸酯類單體或含有環(huán)氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑混合，得到反應(yīng)混合物，其中： 交聯(lián)劑與單體的的物質(zhì)的量的比值為0.25~0.35； 引發(fā)劑與單體的的物質(zhì)的量的比值為0.005~0.03； 致孔劑用量占反應(yīng)混合物體積百分含量的40~80%； 將上述反應(yīng)混合物超聲混合均勻，加入塑料吸附柱管中，原位聚合形成整體床，聚合溫度控制在50~70°C之間，反應(yīng)時間為12~24小時； 將胺類修飾劑溶于有機(jī)溶劑，形成修飾液，利用修飾液對整體床進(jìn)行改性，其中胺類修飾劑占修飾液的體積百分含量為25~75%，修飾溫度控制在50~70℃之間，反應(yīng)時間為12~24小時。 本新型可重復(fù)使用質(zhì)粒提取試劑盒的整體床型質(zhì)粒純化柱配有的系列溶液包括平衡液、清洗液、洗脫液、再生液和儲存液。 通過紅外光譜法（FTIR）分析了不同修飾時間下的整體床色譜柱，不同修飾時間下的整體床型質(zhì)粒純化柱骨架結(jié)構(gòu)基本相同，且12小時以后變化不大。分析圖中數(shù)據(jù)可知，3500 cm-1左右的寬而強(qiáng)的峰是締合氫鍵的吸收峰，可見隨修飾時間的增加其吸收程度增加，證明了二乙胺和環(huán)氧乙烷基反應(yīng)，生成了羥基。3000 cm-1左右的峰是C-N的吸收峰，其含量隨修飾時間的增加而增加；1750 cm-1左右的峰是GMA中的–C=O的伸縮震動峰，說明GMA參與了聚合反應(yīng)，而且含量較多；1400 cm-1 左右的吸收峰是甲基中的CH鍵的吸收峰，可見其含量遞增。900 cm-1左右的峰是環(huán)氧基的峰，可以看出隨聚合時間的增加，其含量逐漸降低； 760 cm-1左右的峰來自TAIC的環(huán)，其峰高隨修飾時間的增加有所下降。 通過元素分析法測定了整體床的功能基團(tuán)含量(以N含量為指標(biāo))隨修飾時間的變化趨勢，隨反應(yīng)時間的增加功能基團(tuán)含量不斷增加，但12小時以后功能基團(tuán)含量增加緩慢。從而確立了整體床型質(zhì)粒純化柱的最佳修飾時間為12小時。 通過掃描電鏡考察不同修飾時間下整體床的微觀形貌，可以看到，聚合物主體為相互融合的球形束，其形貌隨修飾時間增加整體床的微觀形貌并沒有發(fā)生很大改變。修飾后生成了類似渠道的微米級的大孔。 整體床的微孔分布利用BET法測定了整體床型質(zhì)粒純化柱的微孔分布（50納米以下）情況，不同修飾時間下的整體床微孔分布類似。 利用壓汞法測定整體床100納米以上至微米數(shù)量級的孔徑分布情況，不同修飾時間的整體床微米級大孔分布也類似?？讖郊杏?0至100微米間。整體床型質(zhì)粒純化柱中的大孔所占的比例遠(yuǎn)大于微孔。微米級大孔的百分含量很高，這在質(zhì)粒分析的傳質(zhì)過程中非常重要。 根據(jù)紫外分光光度計A260和A280的吸收值，可以確定質(zhì)粒產(chǎn)品的濃度和純度。若A260 /A280的比值在1.8左右，則說明產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量較低，質(zhì)粒純度高。 PGDT試劑盒提取質(zhì)粒樣品紫外風(fēng)光光度計檢測結(jié)果計算A260 /A280值為1.7355，說明樣品中質(zhì)粒純度較高。 新型可重復(fù)使用質(zhì)粒提取試劑盒最大優(yōu)勢在于其可重復(fù)使用，整體床型質(zhì)粒純化柱通過再生后能夠再次用于提取質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)中，對同一根整體床型質(zhì)粒純化柱重復(fù)使用5次，對其質(zhì)粒提取效果進(jìn)行評估。 新型可重復(fù)使用質(zhì)粒提取試劑盒重復(fù)使用5次紫外分析結(jié)果，可以看出，經(jīng)過5次提取質(zhì)粒，樣品紫外分析結(jié)果波動很小，重復(fù)性很高。 進(jìn)一步對紫外結(jié)果分析，求出重復(fù)使用5次所得樣品A260/A280，如表4所示。 表8 新型可重復(fù)使用質(zhì)粒提取試劑盒重復(fù)使用5次紫外分析結(jié)果 循環(huán)使用次數(shù) A260/A280 1 1.803822 2 1.810356 3 1.735536 4 1.731163 5 1.703916 由表8可知，利用新型可重復(fù)使用質(zhì)粒提取試劑盒重復(fù)使用5次所提質(zhì)粒樣品A260/A280基本穩(wěn)定在1.8附近，表明PGDT試劑盒循環(huán)使用效果良好。表8中數(shù)據(jù)顯示，隨著提取次數(shù)的遞增，A260/A280的值在逐漸減小，但總體上變化不大。 進(jìn)一步利用離子交換高效液相色譜對PGDT試劑盒重復(fù)5次所提取質(zhì)粒樣品的重復(fù)性進(jìn)行檢測，得到離子交換高效液相色譜分析結(jié)果，可以看出，重復(fù)使用5次后，所提取質(zhì)粒在離子交換高效液相色譜分析中的出峰時間及位置基本一致，說明重復(fù)使用5次所提取質(zhì)粒純度基本保持一致。重復(fù)使用5次，質(zhì)粒峰高隨重復(fù)次數(shù)增加而降低，說明隨著使用次數(shù)的增加，所提取的質(zhì)粒濃度在逐漸遞減，但波動不大，重復(fù)性良好。 利用瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計、離子交換高效液相色譜等分析方法對新型可重復(fù)使用質(zhì)粒提取試劑盒試劑盒和美國公司大品牌Qiagen試劑盒所提取質(zhì)粒樣品進(jìn)行分析，比較兩者效果可以看出，PGDT試劑盒與Qiagen試劑盒所提取質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳分析中幾乎沒有差異。圖13中紫外分析結(jié)果中，A260/A280的值分別為QIAGEN：1.673165；PGDT：1.735536，兩者差別很小，在某種程度上，新型可重復(fù)使用質(zhì)粒提取試劑盒所提取質(zhì)粒的蛋白質(zhì)含量要較Qiagen少，純度更高。 進(jìn)一步由圖13中兩種試劑盒所提取的質(zhì)粒離子交換高效液相色譜分析結(jié)果可以看出，兩種試劑盒提取的質(zhì)粒樣品的出峰時間和位置非常接近，表明兩種試劑盒提取的質(zhì)粒樣品純度相當(dāng)。從質(zhì)粒峰高角度，新型可重復(fù)使用質(zhì)粒提取試劑盒所提取質(zhì)粒樣品的峰高要比Qiagen樣品高，表明新型可重復(fù)使用質(zhì)粒提取試劑盒提取濃度較Qiagen高，效果更好。 本新型可重復(fù)使用質(zhì)粒提取試劑盒與現(xiàn)有技術(shù)中質(zhì)粒提取試劑盒相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)及突出性效果：該種類型的試劑盒采用由聚合物形成的整體床型質(zhì)粒純化柱，該純化柱具有制備簡單，傳質(zhì)性能好，耐污染能力強(qiáng)，可以多次提取質(zhì)粒樣品，而純化柱性能無明顯改變等優(yōu)點(diǎn)。本試劑盒可重復(fù)使用，質(zhì)粒提取過程方便快捷，成本低和提取樣品純度高，因此有效克服了現(xiàn)有質(zhì)粒提取試劑盒成本高、質(zhì)粒提取純化柱制備復(fù)雜、材料傳質(zhì)性能差、利用率有限、容量低、價格昂貴以及無法重復(fù)使用的缺陷。

作品圖片

  • 新型可重復(fù)使用質(zhì)粒提取試劑盒
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作品專業(yè)信息

設(shè)計、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點(diǎn)、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)

作品設(shè)計、發(fā)明目的和基本思路：針對目前質(zhì)粒提取試劑盒成本高、質(zhì)粒提取純化柱制備復(fù)雜、材料傳質(zhì)性能差、利用率有限、容量低，通常采用的硅膠材料無法重復(fù)使用，而且該產(chǎn)品主要依靠進(jìn)口，價格昂貴。本項(xiàng)目目的是提供一種提取質(zhì)粒純度高、可重復(fù)使用的大幅度降低質(zhì)粒純化操作成本的試劑盒。 創(chuàng)新點(diǎn)：新型可重復(fù)使用質(zhì)粒提取試劑盒采用由聚合物形成的整體床型質(zhì)粒純化柱，該純化柱具有制備簡單，傳質(zhì)性能好，耐污染能力強(qiáng)，可以多次提取質(zhì)粒樣品，而純化柱性能無明顯改變等優(yōu)點(diǎn)。本試劑盒可重復(fù)使用，質(zhì)粒提取過程方便快捷，成本低，提取樣品濃度高，有效克服了現(xiàn)有質(zhì)粒提取試劑盒成本高、質(zhì)粒提取純化柱制備復(fù)雜、材料傳質(zhì)性能差、利用率有效、容量低、價格昂貴及無法重復(fù)使用的缺陷。 技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)：本項(xiàng)目所發(fā)明的新型可重復(fù)使用質(zhì)粒提取試劑盒，包括質(zhì)粒純化柱、質(zhì)粒純化柱配有的系列溶液和菌體裂解液，所述的質(zhì)粒純化柱采用整體床型質(zhì)粒純化柱；整體床型質(zhì)粒純化柱配有的系列溶液包括平衡液、清洗液、洗脫液、再生液和儲存液；菌體裂解液采用現(xiàn)有技術(shù)中通常采用的堿裂解液，包括重懸液、堿液、中和液和RNAse酶液。 利用瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計、離子交換高效液相色譜等分析方法對PGDT試劑盒和Qiagen試劑盒所提取質(zhì)粒樣品進(jìn)行分析，比較兩者效果。本新型質(zhì)粒提取試劑盒與Qiagen試劑盒所提取質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳分析中幾乎沒有差異。本新型質(zhì)粒提取試劑盒所提取質(zhì)粒的蛋白質(zhì)含量要較Qiagen少，純度更高。

科學(xué)性、先進(jìn)性

（1）本新型質(zhì)粒提取試劑盒純化柱采用整體床型質(zhì)粒純化柱，為含有環(huán)氧端基的甲基丙烯酸酯類單體或含有環(huán)氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑聚合所得。該整體床型質(zhì)粒純化柱可重復(fù)使用、能夠大幅度降低質(zhì)粒純化操作成本、制備過程簡單、親水性能好、傳質(zhì)性能優(yōu)良、利用率高、背壓低、提取質(zhì)粒純度高。 （2）該質(zhì)粒純化柱采用原位聚合的方式合成，相比于傳統(tǒng)質(zhì)粒純化柱的球形材料，避免在制備過程中除了包括球形粒子制備步驟外，還需要篩分粒徑適宜的粒子，同時還會受到裝填技術(shù)的影響，更容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)粒的要求。 （3）本新型質(zhì)粒提取試劑盒成功實(shí)現(xiàn)了可重復(fù)使用，為國內(nèi)首創(chuàng)，具有自主知識產(chǎn)權(quán)，符合當(dāng)前節(jié)能減排的方針政策。

獲獎情況及鑒定結(jié)果

本項(xiàng)目已成功申請 2009國家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計劃（獲一萬元項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)支持） 本項(xiàng)目已申請2009 - 2010年度SRT挑戰(zhàn)杯專項(xiàng)（獲一千元經(jīng)費(fèi)支持） 參加校級“挑戰(zhàn)杯”，榮獲二等獎、最佳創(chuàng)意獎 Yuxiong Huang, Lin Jin and Minlian Zhang.?A novel type of plasmid purification kit: PGDT plasmid kit. 1st Annual World Congress of NanoMedicine-2010, Beijing, p408; 靳琳，黃宇雄，張敏蓮.?PGDT型質(zhì)粒提取試劑盒.?第六屆全國化學(xué)工程與生物化工年會，長沙，p296

作品所處階段

實(shí)驗(yàn)室階段

技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式

無

作品可展示的形式

實(shí)物

使用說明,技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢,適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說明,市場分析,經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測

使用說明及該作品的技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢 質(zhì)粒純化柱采用新型材料PGDT，制備簡單，成本低廉； 質(zhì)粒純化柱實(shí)現(xiàn)了重復(fù)使用，性能穩(wěn)定； 質(zhì)粒提取過程方便快捷，成本低，提取樣品濃度高； 可規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化，成批操作，帶來可觀經(jīng)濟(jì)效益。 適應(yīng)范圍：質(zhì)粒提取是分子生物學(xué)和藥用質(zhì)粒研究領(lǐng)域常見的操作。 （1）滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求 所提取質(zhì)?？捎糜诔Ｒ?guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如酶切，PCR，轉(zhuǎn)染等 （2）質(zhì)粒作為基因治療的最重要的基因傳遞系統(tǒng) 以質(zhì)粒為傳遞載體的基因治療和DNA疫苗，可用于癌癥、單基因遺傳病、艾滋病、心血管疾病、關(guān)節(jié)炎等重大疾病的診斷和治療 推廣前景：本項(xiàng)目所發(fā)明的新型質(zhì)粒提取試劑盒，可進(jìn)一步運(yùn)用于藥用質(zhì)粒的規(guī)模制備下游純化產(chǎn)業(yè)，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模藥用質(zhì)粒的純化、分離、分析的集約化生產(chǎn)路線。

同類課題研究水平概述

質(zhì)粒提取是分子生物學(xué)和藥用質(zhì)粒研究領(lǐng)域中常見的操作。近年來，基因治療和DNA 疫苗在癌癥、單基因遺傳病、艾滋病、心血管疾病、關(guān)節(jié)炎等重大疾病的診斷和治療方面顯示了突出的優(yōu)勢，其應(yīng)該研究正日益發(fā)展。目前質(zhì)粒逐漸成為基因治療的最重要的基因傳遞系統(tǒng)，應(yīng)用于基因治療的藥用質(zhì)粒的提取技術(shù)的發(fā)展目前已成為該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)之一。這進(jìn)一步促進(jìn)了高純度質(zhì)粒提取技術(shù)的發(fā)展。 目前常見的質(zhì)粒提取方法有SDS堿裂解法，煮沸法，酚仿有機(jī)抽提法，層析法，沉淀法等。然而這些經(jīng)典的技術(shù)不是快速的，它們需要作若干步操作和材料與試劑的轉(zhuǎn)移，這些不容易做到自動化，也不適合用于純化藥用質(zhì)粒。此外，酚、氯仿等有機(jī)溶劑易造成環(huán)境污染，有損操作者的健康。 質(zhì)粒提取試劑盒因操作方便、提取效率較高成為質(zhì)粒提取最常用的方法。20世界90年代以來，商品化的質(zhì)粒提取試劑盒已經(jīng)非常普遍。試劑盒通常采用堿裂解結(jié)合質(zhì)粒純化柱分離純化的方法提取質(zhì)粒。試劑盒的主要生產(chǎn)廠家有Qiagen、Promega、Life Technologies、Stratagene和Nest Group等國外公司，以及Tiangen和博大等國內(nèi)公司。目前試劑盒中選用的質(zhì)粒純化柱材料通常為硅膠，其分離原理是利用質(zhì)粒與硅膠的吸附作用純化質(zhì)粒，相互作用依賴于DNA的堿基組成和拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)，但該材料的吸附性能會受到片段長度的影響。一般硅膠材料會制成球形，制備過程中除了包括球形粒子制備步驟外，還需要篩分粒徑適應(yīng)的粒子，同時還會受到柱裝填技術(shù)的影響。而質(zhì)粒吸附材料一般采用堿再生，而常用的硅膠型吸附材料由于在堿性環(huán)境下會溶解，而難以重復(fù)使用。目前使用的高純度質(zhì)粒純化柱主要是國外公司出產(chǎn)的Qiagen等進(jìn)口試劑盒，質(zhì)粒提取成本非常高。 目前質(zhì)粒純化材料往往是針對蛋白設(shè)計，其孔徑較小，質(zhì)粒通常無法進(jìn)入分離材料的孔道。因此，前期的質(zhì)粒純化柱存在質(zhì)粒提取成本高、制備復(fù)雜、材料傳質(zhì)性能差、利用率有限、容量低、難以重復(fù)使用等缺陷。
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