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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 產(chǎn)綠原酸金銀花內(nèi)生菌的分離研究
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 金銀花為河南重要的地道藥材，本作品以金銀花為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其根、莖、葉、花不同組織器官的內(nèi)生菌進(jìn)行分離、純化；通過(guò)TLC、HPLC等方法對(duì)篩選出的內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，篩選出3株產(chǎn)綠原酸的菌株，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，對(duì)篩選的高產(chǎn)綠原酸菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化選擇，并對(duì)菌株發(fā)酵液進(jìn)行抑菌學(xué)實(shí)驗(yàn)。為金銀花活性成分-綠原酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
- 詳細(xì)介紹：
- 選取健康金銀花植株的不同組織部位(新鮮根、莖、葉、花)作為內(nèi)生菌分離實(shí)驗(yàn)材料，用平板劃線法，點(diǎn)植法進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中設(shè)有對(duì)照：吸取少量表面消毒中最后一次沖洗材料的無(wú)菌水，涂布于培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)如無(wú)微生物長(zhǎng)出，表明表面消毒徹底，分離到的是內(nèi)生菌。經(jīng)過(guò)反復(fù)分離、篩選、純化出了107株內(nèi)生菌，其后用菌落觀察和鏡檢的方法去除重復(fù)，最終得到86株內(nèi)生菌。對(duì)86株內(nèi)生菌進(jìn)行發(fā)酵后，用TLC法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示次生代謝產(chǎn)物與綠原酸比移值相同的菌株有三株。為了確定這些次生代謝產(chǎn)物是否是含綠原酸，本次實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步用HPLC法對(duì)其進(jìn)行檢查，檢測(cè)結(jié)果與TLC法結(jié)果一致。其后以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌為指示菌，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法對(duì)菌株抑菌活性進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，菌株對(duì)金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌效果與金銀花藥材基本相同，而對(duì)大腸桿菌則表現(xiàn)出較弱的抑菌活性。利用形態(tài)比較法對(duì)菌落、菌絲體、孢子形態(tài)特征的認(rèn)真觀察分析，鑒定3株產(chǎn)綠原酸菌株，分別為毛霉屬、曲霉屬、青霉屬。為了提高內(nèi)生菌產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的效率，對(duì)內(nèi)生菌二次發(fā)酵的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化即：碳源、氮源以及培養(yǎng)溫度進(jìn)一步做了考察，最終確定最適培養(yǎng)條件為：發(fā)酵培養(yǎng)基為PDB培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為28℃，120r/min，震蕩培養(yǎng)72小時(shí)。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 利用金銀花內(nèi)生菌的多樣性，篩選出能產(chǎn)生金銀花主要活性成分綠原酸的菌株，利用其進(jìn)行微生物發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)其主要活性成分，為人類突破植物資源周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低、不可再生等限制。本研究通過(guò)分離金銀花到產(chǎn)綠原酸的菌株，并對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，為今后利用金銀花內(nèi)生菌工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)綠原酸提供科學(xué)理論依據(jù)，具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和研究意義。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 經(jīng)文獻(xiàn)檢索，尚無(wú)發(fā)現(xiàn)有學(xué)者對(duì)金銀花內(nèi)生菌及次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，首次從金銀花中篩選出3株產(chǎn)金銀花綠原酸的菌株，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最佳發(fā)酵條件。對(duì)3株篩選的菌種發(fā)酵液與金銀花進(jìn)行了抑菌對(duì)比試驗(yàn)，抑菌效果與藥材效果基本相同。為金銀花綠原酸發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 基于目前金銀花的生產(chǎn)和需求現(xiàn)狀，利用其內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行微生物發(fā)酵生產(chǎn)，生產(chǎn)其主要活性成分綠原酸，有助于人類突破植物資源周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低、不可再生等因素限制。利用內(nèi)生菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)藥物及生物防治能有效減緩當(dāng)前藥用植物資源逐漸短缺及環(huán)境污染日益嚴(yán)重的情況。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的：通過(guò)對(duì)金銀花不同組織器官內(nèi)生真菌的分離，篩選能產(chǎn)生綠原酸的菌株，通過(guò)菌株的篩選及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得高產(chǎn)綠原酸的發(fā)酵菌株及培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。方法：從金銀花不同組織器官中分離內(nèi)生真菌，通過(guò)分離純化，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行TLC和HPLC分析，同時(shí)利用顯微觀察法對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，對(duì)篩選的高產(chǎn)綠原酸菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化選擇，并對(duì)菌株發(fā)酵液進(jìn)行抑菌學(xué)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：從金銀花中分離篩選到三株純化的的內(nèi)生真菌，其濃縮發(fā)酵液與對(duì)照品有相同的遷移率，保留時(shí)間與對(duì)照品保留時(shí)間一致，結(jié)果表明，三株純化內(nèi)生真菌能產(chǎn)生綠原酸，分別屬于青霉屬，毛霉屬，絲胞綱曲霉屬。經(jīng)過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為PDB培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為28℃,120r/min，震蕩培養(yǎng)72小時(shí)。結(jié)論：金銀花不同器官中具豐富的內(nèi)生菌，并有可產(chǎn)生與宿主相同的活性成分綠原酸，純化的產(chǎn)綠原酸菌株的發(fā)酵液具有明顯的與金銀花相同的抑菌效果。
獲獎(jiǎng)情況
- 2011年河南省第九屆“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品省級(jí)競(jìng)賽特等獎(jiǎng)；2011年河南中醫(yī)學(xué)院第四屆“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品校級(jí)競(jìng)賽二等獎(jiǎng)
鑒定結(jié)果
- 無(wú)
參考文獻(xiàn)
- [1]項(xiàng)勇，崔京霞，呂安國(guó)．東北紅豆杉內(nèi)生真菌的分離和篩選[J]．東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，30(3)：30-34． [2]馬天有，董兆麟．植物分離產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌的研究[J]．西北大學(xué)學(xué)報(bào)，1999．29(1)：47-49． [3] 項(xiàng)勇，崔京霞.東北紅豆杉內(nèi)生真菌的研究[J],東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) ，2002,30（2）：30-34 [4]李海燕．一種桃兒七內(nèi)生真菌的分離初報(bào)．云南大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，21(3):243 [5]一株產(chǎn)鬼臼毒素內(nèi)生真菌發(fā)酵條件的研究[J].西北大學(xué)學(xué)報(bào) [6]魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1979.
同類課題研究水平概述
- 研究發(fā)現(xiàn)某些內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與宿主植物相同或類似的產(chǎn)物，這一發(fā)現(xiàn)可能在一定程度上解決了某些藥物來(lái)源短缺的問(wèn)題。近年來(lái)先后從紅豆杉（Taxus），長(zhǎng)春花等藥用植物中分離得到了內(nèi)生真菌，并從這些藥用植物內(nèi)生真菌中分離得到了和宿主植物研究相同或相似的活性成分。內(nèi)生菌作為許多重要藥用成分的新來(lái)源，可工業(yè)化生產(chǎn)而不受土壤氣候以及資源的限制，從而緩解了藥源的短缺。目前已經(jīng)從紅豆杉、長(zhǎng)春花、銀杏等植物中分離出能產(chǎn)生活性成分的內(nèi)生真菌[1,2,3]。 1993年Stiede首次從短葉紅豆杉(Taxus breviflia)中分離得到一株能合成抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌(Taxomyces andreanae)，此后對(duì)東北紅豆杉也進(jìn)行了研究[3]。云南大學(xué)張玲琪等從桃兒七（Sinopodophyllum hexandrum）的莖中分離到能夠產(chǎn)生鬼臼毒素的內(nèi)生真菌[4,5,6]。從長(zhǎng)春花植株中分離出21株真菌，其中有4 株能夠產(chǎn)生長(zhǎng)春新堿類似物，它們分別屬于鐮刀菌屬、交鏈孢屬和無(wú)孢菌群等， 從桃兒七植株中共分離得到28株真菌，其中有兩株能夠產(chǎn)生鬼臼毒素類似物，它們分別屬于青霉屬和交鏈孢屬。1999年，中山大學(xué)王偉等人從南方紅豆杉(Tchinensis var．mairei)中分離得到87株內(nèi)生真菌，其中有6個(gè)菌株能分泌紫杉烷類化合物，它們分別屬于頭孢霉屬、輪柄梳霉屬和無(wú)孢菌群等。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)， 以上產(chǎn)生與宿主相同或相似生理活性成分的內(nèi)生真菌菌株之間并不存在種屬聯(lián)系，表明內(nèi)生菌具備這一能力并不是偶然現(xiàn)象。這些發(fā)現(xiàn)掀起了一場(chǎng)從藥用植物中分離內(nèi)生菌的熱潮，為人類解決某些藥用植物生長(zhǎng)緩慢、資源短缺等問(wèn)題提供了新思路。
