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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 擬南芥G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白（AtRGS1蛋白）的亞細(xì)胞定位與表達(dá)
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 根據(jù)AtRGS1蛋白的特有結(jié)構(gòu)，克隆表達(dá)AtRGS1的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)證明分段克隆的C端結(jié)構(gòu)域和Gα相互作用，GFP融合蛋白表達(dá)技術(shù)證明：RGS1全長(zhǎng)蛋白及RGS1-N定位于細(xì)胞膜，RGS1-C定位于質(zhì)膜和細(xì)胞核。葡萄糖和ABA處理改變RGS1-F及RGS1-C的細(xì)胞定位表達(dá)，而RGS1-N和RGS1（E320K）定位及表達(dá)未發(fā)生改變。為揭示RGS1蛋白的功能及其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
- 詳細(xì)介紹：
- 異三聚體G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是真核生物中最保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。擬南芥G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白（Regulator of G-protein Signaling Protein in Arabidopsis thaliana，AtRGS1）在G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著十分重要的作用。本文根據(jù)AtRGS1蛋白的特有結(jié)構(gòu)，將編碼AtRGS1的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別進(jìn)行克隆表達(dá)，split-ubiquitin技術(shù)證明分段克隆的C端結(jié)構(gòu)域和G蛋白α亞基相互作用，結(jié)合RGS1-GFP融合蛋白表達(dá)技術(shù)闡明：AtRGS1全長(zhǎng)蛋白（AtRGS1-F和AtRGS1(E320K)）及AtRGS1-N端結(jié)構(gòu)域定位于細(xì)胞膜，AtRGS1-C端結(jié)構(gòu)域定位于質(zhì)膜和細(xì)胞核。AtRGS1-N端結(jié)構(gòu)域在ABA和葡萄糖處理前后都主要分布于細(xì)胞膜上，未發(fā)生遷移，表明在細(xì)胞響應(yīng)脅迫信號(hào)時(shí)，AtRGS1-N端結(jié)構(gòu)域可能在細(xì)胞膜上起到對(duì)外界脅迫信號(hào)感受的作用。AtRGS1-C端結(jié)構(gòu)域在未處理前主要分布于細(xì)胞膜上和細(xì)胞核中，說(shuō)明AtRGS1蛋白在缺少其N端結(jié)構(gòu)域時(shí)，不能特異地定位在細(xì)胞膜上。葡萄糖處理后，AtRGS1-C端結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞膜上和細(xì)胞核中的表達(dá)均有所增強(qiáng)， ABA處理后，AtRGS1-C端結(jié)構(gòu)域在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)均有分布。當(dāng)將RGS結(jié)構(gòu)域第320位谷氨酸點(diǎn)突變?yōu)橘嚢彼幔种屏薘GS的GAP活性，則削弱了葡萄糖和ABA對(duì)RGS蛋白表達(dá)的影響。推斷AtRGS1-N端結(jié)構(gòu)域是AtRGS1蛋白定位于細(xì)胞膜上所必需的，在細(xì)胞響應(yīng)脅迫信號(hào)時(shí)，AtRGS1-C端結(jié)構(gòu)域可以與AtRGS1-N端結(jié)構(gòu)域分離，進(jìn)入胞內(nèi)，進(jìn)行信號(hào)的傳遞。為進(jìn)一步揭示AtRGS1蛋白的生物學(xué)功能和深入研究其在G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
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作品專業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 將AtRGS1進(jìn)行分段克隆表達(dá)，建立相應(yīng)基因型的擬南芥懸浮細(xì)胞系，結(jié)合RGS1-GFP融合蛋白表達(dá)技術(shù)，研究AtRGS1蛋白的細(xì)胞定位及ABA和葡萄糖對(duì)AtRGS1蛋白的細(xì)胞定位和表達(dá)的影響，探討AtRGS1蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在響應(yīng)葡萄糖和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的功能。為進(jìn)一步揭示AtRGS1蛋白的生物學(xué)功能和深入研究其在G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白（RGS）是G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，但有關(guān)植物中RGS蛋白的研究才剛剛起步?！皵M南芥G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白（AtRGS）的亞細(xì)胞定位與表達(dá)” 選題具有科學(xué)性和前沿性；采用分段克隆的方法分別闡述蛋白質(zhì)各結(jié)構(gòu)域的功能，實(shí)驗(yàn)思路和技術(shù)先進(jìn)；其結(jié)果不但可闡明RGS蛋白在細(xì)胞中的分布，揭示其生理功能，而且可為植物中RGS的研究提供系統(tǒng)的植物材料。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 蛋白質(zhì)的“區(qū)域化分布”和“定位控制”是蛋白質(zhì)行使其功能及調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育的重要方面，本研究根據(jù)AtRGS1蛋白的特有結(jié)構(gòu)，將編碼AtRGS1的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別進(jìn)行克隆表達(dá)，結(jié)合RGS1-GFP融合蛋白表達(dá)技術(shù)闡明了AtRGS1蛋白在胞內(nèi)的分布，及ABA和葡萄糖對(duì)AtRGS1定位的影響，為進(jìn)一步深入研究AtRGS1蛋白在ABA和葡萄糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 異三聚體G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是真核生物中最保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。擬南芥G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白（Regulator of G-protein Signaling Protein in Arabidopsis thaliana，AtRGS1）在G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著十分重要的作用。本文根據(jù)AtRGS1蛋白的特有結(jié)構(gòu)，將編碼AtRGS1的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別進(jìn)行克隆表達(dá)，split-ubiquitin技術(shù)證明分段克隆的C端結(jié)構(gòu)域和G蛋白α亞基相互作用，結(jié)合RGS1-GFP融合蛋白表達(dá)技術(shù)闡明：AtRGS1全長(zhǎng)蛋白（AtRGS1-F和AtRGS1(E320K)）及AtRGS1-N端結(jié)構(gòu)域定位于細(xì)胞膜，AtRGS1-C端結(jié)構(gòu)域定位于質(zhì)膜和細(xì)胞核。D-葡萄糖和ABA處理可以改變AtRGS1-F及AtRGS1-C端結(jié)構(gòu)域的亞細(xì)胞定位表達(dá)，而AtRGS1-N端結(jié)構(gòu)域和AtRGS1（E320K）定位及表達(dá)未發(fā)生改變。為進(jìn)一步揭示AtRGS1蛋白的生物學(xué)功能和深入研究其在G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
獲獎(jiǎng)情況
- XX大學(xué)第六屆挑戰(zhàn)杯?動(dòng)感地帶大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽生命科學(xué)類一等獎(jiǎng)。
鑒定結(jié)果
- 查新報(bào)告表明關(guān)于擬南芥G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白（AtRGS1蛋白）的亞細(xì)胞定位與表達(dá)的研究和關(guān)于AtRGS1、N端、C端結(jié)構(gòu)域定位的研究，在國(guó)內(nèi)外公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)中，未見(jiàn)有相同報(bào)道。
參考文獻(xiàn)
- 1.Chal FM, Tu Y, Euskirchen G (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263:802-805； 2.Chen JG, Willard FS, Huang J, Liang J, Chasses SA, Jones AM, Siderovski DP (2003) A seven-transmembrane RGS protein that modulates plant cell proliferation. Science 301:1728-1731； 3.Chen Y, Ji F, Xie H, Liang J, Zhang J (2006) The regulator of G-protein signaling proteins involved in sugar and abscisic acid signaling in Arabidopsis seed germination. Plant Physiology 140:302-310； 4.Chen Y, Ji F, Xie H, Liang J (2006) Overexpression of the regulator of G-protein signaling protein enhances ABA-mediated inhibition of root elongation and drought tolerance in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany 57:2101-2110； 5.Dulin NO, Pratt P, Tiruppathi C, Niu J, Voyno-Yasenetskaya T, Dunn MJ (2000) Regulator of G Protein Signaling RGS3T Is Localized to the Nucleus and Induces Apoptosis. Journal of Biological Chemistry 275(28):21317-21323。
同類課題研究水平概述
- G蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是真核生物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中最為保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制之一，其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短取決于Gα-GTP的壽命。20世紀(jì)90年代，Siderovsiki等三個(gè)實(shí)驗(yàn)室在酵母等真核生物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白（RGS），該蛋白顯著促進(jìn)Gα的GTP水解酶活性，終止G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。在酵母和動(dòng)物細(xì)胞里, RGS和GPCR是兩個(gè)功能相反的分子。但擬南芥的RGS1很有趣，Chen等首次報(bào)道在擬南芥中鑒定到AtRGS1，它的N-端是一個(gè)類似于GPCR的7次跨膜結(jié)構(gòu)域，C端是一個(gè)RGS結(jié)構(gòu)域，遺傳分析顯示RGS1在植物體內(nèi)剛好與激活態(tài)的GPA1的作用相反。RGS1也參與了細(xì)胞分裂和糖信號(hào)的響應(yīng)，但對(duì)AtRGS1蛋白在G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)途徑中的作用，以及其它生物學(xué)功能還不十分清楚。那么，AtRGS1的整體功能，即它是一個(gè)既有GPCR又有RGS雙重功能的蛋白，還是一個(gè)受配體調(diào)控的RGS蛋白，至今還沒(méi)有定論。因此，明確AtRGS1的整體功能顯得十分重要。本課題組首次證明：葡萄糖抑制種子萌發(fā)是通過(guò)ABA生物合成的，AtRGS1通過(guò)調(diào)節(jié)ABA生物合成兩個(gè)關(guān)鍵酶NCED3和ABA2而調(diào)節(jié)ABA生物合成；通過(guò)調(diào)節(jié)ABA合成和ABA響應(yīng)基因的表達(dá)而調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，通過(guò)表達(dá)AtRGS1提高植株對(duì)ABA的敏感性，增加了對(duì)干旱脅迫的忍耐。說(shuō)明RGS1在脫落酸和葡萄糖信號(hào)途徑及其它途徑中起重要的調(diào)節(jié)作用。動(dòng)物中，RGS通常還含有一個(gè)或多個(gè)別的結(jié)構(gòu)域，參與了胞內(nèi)其它信號(hào)途徑。擬南芥AtRGS1除了RGS結(jié)構(gòu)域的功能得到驗(yàn)證以外，它的N端結(jié)構(gòu)域功能和整體功能尚不清楚。Grigiston報(bào)道AtRGS1通過(guò)其N端結(jié)構(gòu)域與AtGPA1相互作用，可能作為葡萄糖的膜響應(yīng)元件。在細(xì)胞水平，AtRGS1作為一個(gè)膜蛋白，定位于細(xì)胞膜，但ABA和葡萄糖處理增加了AtRGS1在核區(qū)的表達(dá)（Chen et al.,待發(fā)表數(shù)據(jù)）。那么，感受外界信號(hào)的是AtRGS1全蛋白，還是某個(gè)結(jié)構(gòu)域？其上下游的效應(yīng)蛋白有哪些？AtRGS1胞內(nèi)表達(dá)變化與ABA和葡萄糖信號(hào)傳遞有何聯(lián)系？蛋白質(zhì)的“區(qū)域化分布”和“定位控制”是蛋白質(zhì)行使其功能的重要方面，本文旨在闡明AtRGS1的胞內(nèi)分布，及ABA和葡萄糖對(duì)AtRGS1定位的影響，為深入研究AtRGS1蛋白的作用機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。
