基本信息
- 項目名稱：
- 中藥鉤藤的分子生物學與化學鑒定
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 本項目運用rDNA ITS區(qū)序列測序分析和系統發(fā)育樹構建的分子生物學方法，聯合HPLC—DAD技術與中藥色譜相似度評價系統的化學分析方法，對鉤藤屬植物進行準確的種間鑒定。
- 詳細介紹：
- 鉤藤中藥材的化學成分研究表明，其主要有效成分為生物堿，但不同種的藥效成分有明顯的差別。目前，中藥鉤藤的分類鑒定主要依據形態(tài)學、組織學和化學成分等傳統分析方法，由于這些方法的局限性，鉤藤中藥材在中藥市場上的分類鑒定比較混亂，在藥材使用上存在互混、互代、以次充好等現象，影響了用藥的安全性和有效性。 在DNA保存完整的情況下，對親緣關系相近的鉤藤屬植物進行鑒別，DNA分子鑒定技術無疑是最直觀的方法。但是，加工炮制或萃取后的中藥材鉤藤核酸已被破壞，DNA 分子鑒定技術不適用于中藥材成品的鑒定。而化學成分分析方法可以很好地反映藥材成品的化學本質，可根據鉤藤屬成品的化學成分及其含量的不同對其進行種間鑒別。因此，聯合運用分子生物學和化學成分分析技術進行鉤藤屬不同種間的鑒定，既提高了鉤藤屬中藥鑒定的準確度又擴大了鑒定方法的適用范圍。 在分子生物學上，采用改良CTAB法提取鉤藤總DNA，并進行rDNA ITS區(qū)的PCR擴增。對擴增產物進行膠回收純化，再連接到質粒載體中，接著轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)過夜進行藍白斑篩選。最后將含鉤藤rDNA ITS區(qū)序列的克隆子進行測序，得到的序列通過與國際基因數據庫中已有的ITS區(qū)序列進行比較分析，對鉤藤屬種間進行鑒定。 在化學成分分析上，提取鉤藤屬樣品生物堿后采用高效液相色譜法分離有效生物堿，再以色譜聯用技術獲得鉤藤屬生物堿的色譜圖，并與對照品溶液（由已鑒定的鉤藤藥材制備）的色譜圖進行對比分析以定性鑒別。最后用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統對收集到的生物堿色譜圖和鉤藤對照藥材進行比較，鑒定鉤藤屬藥材。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 聯合應用分子生物學技術和化學成分分析技術，對鉤藤屬種間進行鑒定。在分子生物學上，用改良CTAB法提取鉤藤總DNA，并進行rDNA ITS區(qū)的PCR擴增。經克隆、測序后，運用軟件進行序列分析和構建系統發(fā)育樹。在化學成分分析上，采用高效液相色譜法及色譜聯用技術獲得鉤藤樣品及對照品生物堿色譜圖。最后用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統對收集到的生物堿色譜圖進行比較分析，鑒定鉤藤屬藥材。
科學性、先進性及獨特之處
- 本作品結合rDNA ITS序列分析技術與化學成分分析技術，對鉤藤屬種間進行鑒定。而且，對其不同種間進行鑒定的研究還很少。因此，本作品在方法和在內容上都具有獨特之處。方法上，聯合運用以上兩種方法，既提高了鑒定的準確度又擴大了方法的適用范圍；內容上，雖然鉤藤屬中藥具有較高的藥用價值，但相應鑒定技術還不夠成熟，市場上以次充好現象較多，限制其推廣。本項目提供了更準確全面的鑒定方法，將對其推廣有積極作用。
應用價值和現實意義
- 針對鉤藤中藥材在中藥市場上的分類鑒定比較混亂，本研究小組聯合運用分子生物學和化學成分分析技術進一步對鉤藤屬種間進行鑒定，能夠解決鉤藤屬中藥材在使用上存在的互混、互代、以次充好等現象，提高用藥的安全性和有效性。
學術論文摘要
- 目的 通過測定鉤藤屬植物核糖體轉錄間隔（rDNA ITS）序列和分析鉤藤的HPLC色譜圖，同時對其進行分類鑒定。 方法 1）通過改良CTAB法提取2010年《中國藥典》中記載的五種入藥鉤藤植物總DNA，利用通用引物對rDNA ITS序列進行PCR擴增，將測序后得到的序列與國際基因數據庫中已有的ITS區(qū)序列進行比較分析。運用Clustal X，BioEdit和PAUP等軟件進行序列分析和構建系統發(fā)育樹；2）以已鑒定的鉤藤對照品為參照，采用HPLC-DAD聯用技術，并應用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A）對收集到的生物堿色譜圖和購自中國藥品生物制品檢定所的鉤藤對照藥材進行比較，以實現鉤藤屬種間的分類鑒定。 結果 1）獲得五種入藥鉤藤的rDNA ITS區(qū)的完整序列并構建鉤藤屬植物的系統發(fā)育樹；2）獲得五種鉤藤的HPLC色譜圖譜及其與對照圖譜的相似度比較。 結論 通過rDNA ITS序列進行序列測定，能夠對鉤藤屬植物進行準確的分子鑒定，HPLC-DAD聯用技術則能快速地對鉤藤屬中藥材成品進行鑒定。兩種方法互補，既提高了鉤藤屬中藥鑒定的準確度又擴大了鑒定方法的適用范圍。
獲獎情況
- 1.獲得廣東藥學院2010年校級大學生創(chuàng)新實驗項目立項資格； 2.2010年10月在國家核心期刊“中草藥”上發(fā)表論文：毛鉤藤和無柄果鉤藤的ITS序列分析研究； 3.2011年3月在國家核心期刊“中國中藥雜志”上發(fā)表實驗論文：一種鉤藤屬植物的分子鑒定。
鑒定結果
- rDNA ITS區(qū)序列的測序分析和系統發(fā)育樹構建的分子生物學方法，以及HPLC—DAD技術與中藥色譜相似度評價系統的化學分析方法，能夠對鉤藤屬植物進行準確的種間鑒定，為其鑒定和分類提供了科學理論依據。
參考文獻
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同類課題研究水平概述
- 鉤藤具有清熱平肝、息風定驚之功效，用于治療風熱頭痛、頭暈目眩等癥，為中醫(yī)兒科要藥和現代治療高血壓方劑中的常用藥材。目前，中藥鉤藤的分類鑒定主要依據形態(tài)學、組織學和化學成分等傳統分析方法，由于這些方法的局限性，鉤藤中藥材在中藥市場上的分類鑒定比較混亂，影響了用藥的安全性和有效性。分子生物學技術已在藥用植物的分子系統發(fā)育分析中廣泛地應用，但對鉤藤屬植物的資源調查和種間分子鑒定等基礎研究工作還少有報導，僅有陶剛曾對貴州中藥材鉤藤屬植物進行分子鑒定并歸類到屬。近十年，國內外鉤藤屬種間鑒定等調查研究方面的基礎工作還很少，國內僅有不超過5篇關于中藥鉤藤鑒定研究的文獻，其中貴州省研究人員發(fā)表了鉤藤的有效成分、藥理活性、資源分布等方面的研究論文約3篇。這些研究現狀表明，當前對中藥鉤藤屬植物的鑒定仍然缺乏深入的研究。所以，探索出更簡單有效的方法來進行鉤藤屬種間鑒定是迫切的。
