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基本信息
- 項(xiàng)目名稱(chēng)：
- p14多肽——新型黃科病毒解螺旋酶抑制劑的克隆表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建及抗病毒研究
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”作品
- 小類(lèi)：
- 生命科學(xué)
- 大類(lèi)：
- 自然科學(xué)類(lèi)學(xué)術(shù)論文
- 簡(jiǎn)介：
- 目的：研究新型抗病毒肽-豬瘟病毒p14肽對(duì)豬瘟病毒的抗性研究。方法：通過(guò)SOE PCR法擴(kuò)增目的基因，基因片段克隆至pET32a（+）質(zhì)粒中，構(gòu)建重組原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)出的原核蛋白純化后，采用實(shí)時(shí)定量PCR法和間接免疫熒光法對(duì)4種黃科病毒的進(jìn)行抗性研究。同時(shí)將TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)域同p14肽相結(jié)合。結(jié)果：通過(guò)兩種方法的對(duì)比，豬瘟病毒p14肽抗豬瘟病毒效果最明顯，TAT-p14串聯(lián)肽抗病毒效果更強(qiáng)。
- 詳細(xì)介紹：
- 黃病毒科病是一種重要的引起嚴(yán)重疾病的動(dòng)物傳染病病原體，調(diào)查表明黃病毒科病毒存在一段保守蛋白：p14蛋白。這種蛋白表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗病毒活性，也是一種發(fā)展?jié)摿薮蟮目共《镜闹委熕幬?。在本?xiàng)目中，我們主要研究作為豬瘟病毒NS3解旋酶抑制劑的p14蛋白對(duì)豬瘟病毒的抑制作用。我們首先鑒定了p14蛋白的抗病毒活性，然后將p14蛋白同HIV-1 TAT蛋白串聯(lián)結(jié)合，有利于蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。p14蛋白在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出很高的抗病毒活性，我們就此猜測(cè)串聯(lián)多肽在p14蛋白的基礎(chǔ)上活性會(huì)有所提高。因此，在本項(xiàng)目中，我們首次將p14蛋白應(yīng)用于抗豬瘟病毒的活性研究，結(jié)果證實(shí)p14蛋白的確對(duì)豬瘟病毒具有良好的抗性。在此基礎(chǔ)上，我們又將p14蛋白同TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)域相結(jié)合，研究串聯(lián)多肽的抗病毒性。結(jié)果證實(shí)，串聯(lián)多肽比單一的p14蛋白活性有一定的提高。
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作品專(zhuān)業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 目的:本項(xiàng)目以豬瘟病毒為研究對(duì)象，試圖開(kāi)發(fā)出一種綠色環(huán)保的蛋白質(zhì)抗病毒藥物：抗豬瘟病毒p14肽?；舅悸罚?、TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，p14蛋白基因的克隆、表達(dá)和純化。2、基因工程表達(dá)TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，p14蛋白以及聯(lián)合蛋白的研究。3、TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，p14蛋白以及聯(lián)合蛋白體外抗病毒活性比較。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 利用豬瘟病毒體內(nèi)本身含有的一段基因序列，表達(dá)出的蛋白，可通過(guò)抑制病毒解螺旋活性，影響病毒的復(fù)制，殺滅病毒自身。 （1）本課題初次應(yīng)用對(duì)載體密碼子的改造來(lái)優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)，證明該系統(tǒng)穩(wěn)定性好，通透性強(qiáng)，活性好。 （2）本課題首次將p14肽應(yīng)用于豬瘟病毒的檢測(cè)。 （3）本課題首次將TAT同p14肽相結(jié)合，形成串聯(lián)式抗病毒肽。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- （1）本研究合成的豬瘟p14蛋白為抗豬瘟病毒藥物研發(fā)提供了一個(gè)新方向，并打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。 （2）在體外實(shí)驗(yàn)中證明，此p14蛋白的抗豬瘟病毒濃度是ug級(jí)別，即只需少量的多肽即可達(dá)到抗病毒的效果。 （3）基因過(guò)程技術(shù)表達(dá)的p14蛋白僅針對(duì)病毒發(fā)揮作用，對(duì)細(xì)胞沒(méi)有影響，不會(huì)因此而造成副作用。 （4）應(yīng)用基因工程技術(shù)制備p14蛋白，目的抗病毒基因可源源不斷的制備蛋白，原料成本極低。
學(xué)術(shù)論文摘要
- Flaviviridae viruses are important zoonosis pathogens which cause serve diseases. Report showed that Flaviviridae viruses have a conservative protein motif (14aa).Therefore, our studies focus on this 14aa antiviral peptide which acts as a classical swine fever virus NS3 helicase inhibitor. We determined the antiviral activity of the 14aa peptide first. Combined the 14aa peptide with HIV-1 TAT peptide, which helps protein transduction in cells.
獲獎(jiǎng)情況
- 1.本項(xiàng)目立項(xiàng)于2009年，為我省大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，2010年結(jié)題。編號(hào)為DFCS200902。 2.在《中國(guó)生物制品學(xué)》雜志上發(fā)表論文《HIV-Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的研究進(jìn)展》。 3.核心內(nèi)容已投SCI雜志《Journal of veterinary medical science》。
鑒定結(jié)果
- 1、目前未見(jiàn)將p14肽應(yīng)用于豬瘟病毒的相關(guān)報(bào)導(dǎo)。 2、目前未見(jiàn)CSFV p14肽，BVDV p14肽，JEV p14肽，HCV p14肽抗豬瘟病毒活性對(duì)比研究的報(bào)導(dǎo)。
參考文獻(xiàn)
- 1.Kerkis A, Hayashi MA, Yamane T, et al. Properties of cell penetrating peptides (CPPs). IUBMB Life 2006; 58(1):7-13. 2.Ganges L, Nú?ez JI, Sobrino F, Borrego B, Fernández-Borges N, Frías-Lepoureau MT, Rodríguez F Recent advances in the development of recombinant vaccines against classical swine fever virus: Cellular responses also play a role in protection. The Veterinary Journal 2008； 177:169-77. 3.Mae M, Langel U. Cell-penetrating peptides as vectors for peptide, protein and oligonucleotide delivery. Curr Opin Phamacol 2006; 6(5):509-514. 4. Rachmat H, Motoko NF, Lin D, et al. Hepatitis C virus NS3 protein interacts with ELKS-d and ELKS-a, members of a novel protein family involved in intracellular transport and secretory pathways. J Gen Virol 2005; 86:2197-2208. 5. Khan AA, Babu JP, Gupta G, Rao DN Identifying B and T cell epitopes and studying humoral, mucosal and cellular immune responses of peptides derived from V antigen of Yersinia pestis. Vaccine2008；26:316-332.
同類(lèi)課題研究水平概述
- 1、病毒性感染一直是困擾人及動(dòng)物健康的重要問(wèn)題，目前還沒(méi)有找到一種可以直接消滅病毒感染的藥物。國(guó)內(nèi)外絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，病毒感染的治療需要從抑制病毒感染機(jī)體的各個(gè)階段入手，研制對(duì)病毒感染多方面起作用并有分子可塑性的抗病毒蛋白對(duì)防治病毒感染有重要價(jià)值。科學(xué)家先是從昆蟲(chóng)體內(nèi)提取出某些蛋白，這些蛋白對(duì)特異性的病毒有抑制或殺傷作用，這些蛋白被稱(chēng)之為抗病毒肽。隨后，科學(xué)家又在多種抗病毒肽中發(fā)現(xiàn)一種含14個(gè)氨基酸的小肽p14，可以抑制黃病毒科乙肝病毒的解螺旋酶。 2、豬瘟病毒一直是威脅養(yǎng)殖業(yè)的一個(gè)重要病原。對(duì)于豬瘟病毒，我國(guó)一直采取接種疫苗的政策，并且在過(guò)去較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)效果明顯，豬瘟得到了有效地控制。但是最近很多研究檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，豬瘟發(fā)病出現(xiàn)許多非典型癥狀，病毒在與疫苗的對(duì)抗中也漸漸發(fā)生變異，有逃避免疫的傾向。而許多接種過(guò)疫苗的動(dòng)物仍檢測(cè)到了豬瘟病毒存在。因此，研究出一種高效抗病毒并能適應(yīng)病毒新變異的抗病毒多肽就顯得尤為重要。 3、科學(xué)家已證實(shí)p14蛋白在丙型肝炎病毒感染中發(fā)揮抑制作用。p14可通過(guò)結(jié)合病毒的解旋酶或絲氨酸蛋白酶，干擾病毒解螺旋作用而抑制病毒復(fù)制，是一種新發(fā)現(xiàn)的病毒抑制蛋白。 4、綜上，我們研究室基于p14蛋白對(duì)黃病毒科病毒解螺旋酶的抑制作用，提出一個(gè)假想。猜測(cè)體外人工大量合成的p14蛋白，可以通過(guò)抑制病毒解螺旋酶活性治療豬瘟疫。同時(shí)，本研究室嘗試將TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)域同p14肽相結(jié)合，期望能增強(qiáng)細(xì)胞穿透性，進(jìn)一步提高抗病毒性。
