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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控胞嘧啶脫氨酶的抗腫瘤研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- BIRC5是在大多數(shù)惡性腫瘤中特異性高表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原，本研究克隆了其啟動(dòng)子，并利用報(bào)告基因GFP首先確定了其表達(dá)的腫瘤特異性，然后將克隆自釀酒酵母的前藥基因胞嘧啶脫氨酶（CD）置于其調(diào)控之下，轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后加入5-FC，毛細(xì)管電泳檢測(cè)表明BIRC5調(diào)控的CD能夠有效地將5-FC轉(zhuǎn)化成5-FU，從而殺傷腫瘤細(xì)胞，本研究為下一步體內(nèi)的靶向性抗腫瘤研究及開發(fā)特異性的抗腫瘤基因藥物奠定了良好的基礎(chǔ)。
- 詳細(xì)介紹：
- 手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)藥物治療是惡性腫瘤治療的傳統(tǒng)手段，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，生物治療日趨重要，而尋找有效的靶向性抗腫瘤治療方法是生物治療重要的研究方向之一。 BIRC5，又稱為survivin，是凋亡抑制蛋白家族的成員之一，它表達(dá)于絕大部分常見的惡性腫瘤細(xì)胞中，但是在大部分正常組織中表達(dá)缺失或極低，是重要的腫瘤相關(guān)抗原。某些微生物的胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase，CD）能夠把5-氟胞嘧啶（5-FC）轉(zhuǎn)化成5-氟尿嘧啶（5-FU），通過抑制DNA的合成誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。由于CD能將原本無毒的前體藥物5-FC轉(zhuǎn)化成具有細(xì)胞毒性的化療藥物5-FU，因此被稱為“前藥基因”或者“自殺基因”。本研究擬利用BIRC5啟動(dòng)子特異性地調(diào)控CD基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，配合5-FC處理，從而達(dá)到靶向性抗腫瘤的作用。 本研究首先克隆了BIRC5的啟動(dòng)子，利用報(bào)告基因GFP檢測(cè)其調(diào)控下游基因的表達(dá)情況，通過分析GFP在不同細(xì)胞中的表達(dá)譜，表明克隆的BIRC5啟動(dòng)子具有良好的腫瘤相關(guān)性。然后克隆釀酒酵母的CD基因，將其置于BIRC5啟動(dòng)子的調(diào)控之下，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pSP-CD，將含有BIRC5啟動(dòng)子和釀酒酵母CD基因的pSP-CD轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，再加入5-FC進(jìn)行處理。毛細(xì)管電泳檢測(cè)表明轉(zhuǎn)染了pSP-CD的腫瘤細(xì)胞能夠有效地將5-FC轉(zhuǎn)化為5-FU，微分干涉相差顯微鏡觀察也顯示BIRC5啟動(dòng)子調(diào)控下的CD/5-FC自殺系統(tǒng)能夠靶向、有效地殺傷腫瘤細(xì)胞株HepG2；而在非腫瘤細(xì)胞株HEK-293對(duì)照組中，pSP-CD沒有誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。通過這一研究結(jié)果，希望為靶向性抗腫瘤生物治療和開發(fā)腫瘤特異性的基因藥物提供新思路。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，基因治療成為惡性腫瘤治療研究的一個(gè)活躍領(lǐng)域，而基因治療的關(guān)鍵問題是靶向性。BIRC5是在大多數(shù)惡性腫瘤中高表達(dá)而在正常組織和細(xì)胞中表達(dá)缺失或極低的重要的腫瘤相關(guān)抗原，而某些微生物的胞嘧啶脫氨酶能夠把無毒的5-FC轉(zhuǎn)化成具有細(xì)胞毒性的5-FU，本研究擬將兩者的優(yōu)勢(shì)聯(lián)合起來，利用BIRC5啟動(dòng)子特異性地調(diào)控CD基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，希望為靶向性抗腫瘤治療研究提供有益的借鑒。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- BIRC5表達(dá)于絕大部分常見的惡性腫瘤細(xì)胞中，在大部分正常組織中表達(dá)缺失或極低；微生物的胞嘧啶脫氨酶（CD）能夠把無毒的5-FC轉(zhuǎn)化成具有細(xì)胞毒性的5-FU。本研究利用BIRC5啟動(dòng)子特異性地調(diào)控CD基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，從而達(dá)到靶向性抗腫瘤的目的。所用CD基因來自釀酒酵母，轉(zhuǎn)化5-FC的效率高于大腸桿菌CD；利用毛細(xì)管電泳檢測(cè)對(duì)5-FC的轉(zhuǎn)化效率，直觀明確的表明細(xì)胞凋亡和5-FC轉(zhuǎn)化之間的聯(lián)系。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 腫瘤的生物治療越來越為研究者所關(guān)注，但是目前治療的靶向性仍是治療的難題之一。本文的價(jià)值和意義在于，通過將具有高度腫瘤特異性的BIRC5啟動(dòng)子與定點(diǎn)殺傷靶細(xì)胞的CD自殺基因系統(tǒng)結(jié)合起來，充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢(shì)，達(dá)到特異性殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常組織影響較小的目的，從而為靶向性抗腫瘤生物治療以及開發(fā)腫瘤特異性的基因藥物提供前期的研究基礎(chǔ)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的：利用BIRC5啟動(dòng)子的腫瘤特異性調(diào)控前藥基因胞嘧啶脫氨酶（CD）的表達(dá)，使其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)將無毒的5-FC轉(zhuǎn)化為化療藥物5-FU，探討B(tài)IRC5啟動(dòng)子調(diào)控下CD/5-FC自殺系統(tǒng)的抗腫瘤效果。方法：利用PCR擴(kuò)增BIRC5啟動(dòng)子，將其替換掉pEGFP-N1載體上的CMV啟動(dòng)子，構(gòu)建成真核重組表達(dá)載體pSP-EGFP，轉(zhuǎn)染不同的細(xì)胞系，通過報(bào)告基因綠色熒光蛋白（EGFP）的表達(dá)譜分析所克隆BIRC5啟動(dòng)子的腫瘤特異性；擴(kuò)增釀酒酵母的CD基因，將其克隆在pSP-EGFP的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建成重組載體pSP-CD；將CD轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后加入5-FC，利用毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)對(duì)前藥的轉(zhuǎn)化效率，同時(shí)通過微分干涉差顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。結(jié)果：EGFP的表達(dá)譜分析表明克隆的BIRC5啟動(dòng)子具有良好的腫瘤相關(guān)性；毛細(xì)管電泳檢測(cè)表明腫瘤細(xì)胞中的CD能夠有效地將5-FC轉(zhuǎn)化為5-FU，微分干涉差顯微鏡和流式分析顯示BIRC5啟動(dòng)子調(diào)控下的CD能夠有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。結(jié)論：BIRC5啟動(dòng)子具有顯著的腫瘤特異性，能有效地啟動(dòng)CD基因的表達(dá)，達(dá)到靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。
獲獎(jiǎng)情況
- 擬申請(qǐng)專利1項(xiàng)，投稿1篇。
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
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同類課題研究水平概述
- 當(dāng)前腫瘤基因治療研究中廣泛應(yīng)用的自殺基因主要有：單純皰疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）和胞嘧啶脫氨酶基因（CD）。胸腺激酶將GCV轉(zhuǎn)換成一種磷酸化的有毒代謝物（GCV-P）抑制DNA聚合酶，導(dǎo)致DNA鏈合成終止。CD將無毒的前藥5-氟胞嘧啶（5-FC）脫氨基轉(zhuǎn)化為有細(xì)胞毒性的化療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU），后者最終代謝產(chǎn)物FdUMP能抑制胸苷酸合酶，導(dǎo)致dTTP池的耗盡而最終抑制DNA的合成。CD/5-FC系統(tǒng)相較于HSV-TK/GCV系統(tǒng)有一定的潛在的優(yōu)勢(shì)：首先，CD/5-FC系統(tǒng)產(chǎn)生的5-FU已經(jīng)是臨床上常用的化療藥物；其次，CD/5-FC系統(tǒng)有更強(qiáng)的旁觀者效應(yīng)，GCV-P需要細(xì)胞間隙連接通訊來殺傷未轉(zhuǎn)化的臨近腫瘤細(xì)胞，然而細(xì)胞間隙連接通訊在腫瘤細(xì)胞中經(jīng)常缺失，而5-FU則無需間隙連接也能殺傷未轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 目前關(guān)于利用自殺基因進(jìn)行抗腫瘤的研究中，大多集中在通過CD和TK聯(lián)用，或者與放化療等手段聯(lián)用達(dá)到改進(jìn)自殺基因殺傷效果的目的。通過腫瘤特異性的啟動(dòng)子對(duì)自殺基因進(jìn)行調(diào)控的研究還比較少，并且研究的不夠深入，如對(duì)前藥的轉(zhuǎn)化效率等具體機(jī)制涉及的不多。 關(guān)于BIRC5啟動(dòng)子的研究，Bao R，Connolly DC 等人的研究結(jié)果表明，BIRC5基因啟動(dòng)子可特異在腫瘤而非正常細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，活性高于SV40啟動(dòng)子，說明腫瘤細(xì)胞中存在與正常細(xì)胞不同的轉(zhuǎn)錄因子譜，能特異激活BIRC5啟動(dòng)子，而該啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞中啟動(dòng)下游基因表達(dá)的能力并沒有組織或細(xì)胞特異性。Tang等對(duì)BIRC5啟動(dòng)子在淋巴瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明BIRC5啟動(dòng)子在淋巴瘤細(xì)胞中具有較高的特異性。Chen等對(duì)BIRC5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Trail誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的進(jìn)行研究，表明含該啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒在腫瘤細(xì)胞中能增強(qiáng)Trail蛋白的表達(dá),并能誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡。 就目前的研究進(jìn)展來看，對(duì)于利用BIRC5啟動(dòng)子調(diào)控CD基因進(jìn)行靶向性抗腫瘤的研究還有待進(jìn)一步加深，對(duì)相關(guān)的抗腫瘤效果和詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究和探索。
