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基本信息
- 項目名稱：
- 腫瘤特異性啟動子調(diào)控胞嘧啶脫氨酶的抗腫瘤研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- BIRC5是在大多數(shù)惡性腫瘤中特異性高表達的腫瘤相關(guān)抗原，本研究克隆了其啟動子，并利用報告基因GFP首先確定了其表達的腫瘤特異性，然后將克隆自釀酒酵母的前藥基因胞嘧啶脫氨酶（CD）置于其調(diào)控之下，轉(zhuǎn)染腫瘤細胞后加入5-FC，毛細管電泳檢測表明BIRC5調(diào)控的CD能夠有效地將5-FC轉(zhuǎn)化成5-FU，從而殺傷腫瘤細胞，本研究為下一步體內(nèi)的靶向性抗腫瘤研究及開發(fā)特異性的抗腫瘤基因藥物奠定了良好的基礎(chǔ)。
- 詳細介紹：
- 手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)藥物治療是惡性腫瘤治療的傳統(tǒng)手段，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，生物治療日趨重要，而尋找有效的靶向性抗腫瘤治療方法是生物治療重要的研究方向之一。 BIRC5，又稱為survivin，是凋亡抑制蛋白家族的成員之一，它表達于絕大部分常見的惡性腫瘤細胞中，但是在大部分正常組織中表達缺失或極低，是重要的腫瘤相關(guān)抗原。某些微生物的胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase，CD）能夠把5-氟胞嘧啶（5-FC）轉(zhuǎn)化成5-氟尿嘧啶（5-FU），通過抑制DNA的合成誘導(dǎo)細胞的凋亡。由于CD能將原本無毒的前體藥物5-FC轉(zhuǎn)化成具有細胞毒性的化療藥物5-FU，因此被稱為“前藥基因”或者“自殺基因”。本研究擬利用BIRC5啟動子特異性地調(diào)控CD基因在腫瘤細胞中表達，配合5-FC處理，從而達到靶向性抗腫瘤的作用。 本研究首先克隆了BIRC5的啟動子，利用報告基因GFP檢測其調(diào)控下游基因的表達情況，通過分析GFP在不同細胞中的表達譜，表明克隆的BIRC5啟動子具有良好的腫瘤相關(guān)性。然后克隆釀酒酵母的CD基因，將其置于BIRC5啟動子的調(diào)控之下，構(gòu)建成重組表達載體pSP-CD，將含有BIRC5啟動子和釀酒酵母CD基因的pSP-CD轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，再加入5-FC進行處理。毛細管電泳檢測表明轉(zhuǎn)染了pSP-CD的腫瘤細胞能夠有效地將5-FC轉(zhuǎn)化為5-FU，微分干涉相差顯微鏡觀察也顯示BIRC5啟動子調(diào)控下的CD/5-FC自殺系統(tǒng)能夠靶向、有效地殺傷腫瘤細胞株HepG2；而在非腫瘤細胞株HEK-293對照組中，pSP-CD沒有誘導(dǎo)明顯的細胞凋亡現(xiàn)象。通過這一研究結(jié)果，希望為靶向性抗腫瘤生物治療和開發(fā)腫瘤特異性的基因藥物提供新思路。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，基因治療成為惡性腫瘤治療研究的一個活躍領(lǐng)域，而基因治療的關(guān)鍵問題是靶向性。BIRC5是在大多數(shù)惡性腫瘤中高表達而在正常組織和細胞中表達缺失或極低的重要的腫瘤相關(guān)抗原，而某些微生物的胞嘧啶脫氨酶能夠把無毒的5-FC轉(zhuǎn)化成具有細胞毒性的5-FU，本研究擬將兩者的優(yōu)勢聯(lián)合起來，利用BIRC5啟動子特異性地調(diào)控CD基因在腫瘤細胞中表達，希望為靶向性抗腫瘤治療研究提供有益的借鑒。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- BIRC5表達于絕大部分常見的惡性腫瘤細胞中，在大部分正常組織中表達缺失或極低；微生物的胞嘧啶脫氨酶（CD）能夠把無毒的5-FC轉(zhuǎn)化成具有細胞毒性的5-FU。本研究利用BIRC5啟動子特異性地調(diào)控CD基因在腫瘤細胞中表達，從而達到靶向性抗腫瘤的目的。所用CD基因來自釀酒酵母，轉(zhuǎn)化5-FC的效率高于大腸桿菌CD；利用毛細管電泳檢測對5-FC的轉(zhuǎn)化效率，直觀明確的表明細胞凋亡和5-FC轉(zhuǎn)化之間的聯(lián)系。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 腫瘤的生物治療越來越為研究者所關(guān)注，但是目前治療的靶向性仍是治療的難題之一。本文的價值和意義在于，通過將具有高度腫瘤特異性的BIRC5啟動子與定點殺傷靶細胞的CD自殺基因系統(tǒng)結(jié)合起來，充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢，達到特異性殺傷腫瘤細胞而對正常組織影響較小的目的，從而為靶向性抗腫瘤生物治療以及開發(fā)腫瘤特異性的基因藥物提供前期的研究基礎(chǔ)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的：利用BIRC5啟動子的腫瘤特異性調(diào)控前藥基因胞嘧啶脫氨酶（CD）的表達，使其在腫瘤細胞內(nèi)將無毒的5-FC轉(zhuǎn)化為化療藥物5-FU，探討B(tài)IRC5啟動子調(diào)控下CD/5-FC自殺系統(tǒng)的抗腫瘤效果。方法：利用PCR擴增BIRC5啟動子，將其替換掉pEGFP-N1載體上的CMV啟動子，構(gòu)建成真核重組表達載體pSP-EGFP，轉(zhuǎn)染不同的細胞系，通過報告基因綠色熒光蛋白（EGFP）的表達譜分析所克隆BIRC5啟動子的腫瘤特異性；擴增釀酒酵母的CD基因，將其克隆在pSP-EGFP的多克隆位點中，構(gòu)建成重組載體pSP-CD；將CD轉(zhuǎn)染腫瘤細胞后加入5-FC，利用毛細管電泳儀檢測對前藥的轉(zhuǎn)化效率，同時通過微分干涉差顯微鏡觀察和流式細胞儀檢測分析殺傷腫瘤細胞的效果。結(jié)果：EGFP的表達譜分析表明克隆的BIRC5啟動子具有良好的腫瘤相關(guān)性；毛細管電泳檢測表明腫瘤細胞中的CD能夠有效地將5-FC轉(zhuǎn)化為5-FU，微分干涉差顯微鏡和流式分析顯示BIRC5啟動子調(diào)控下的CD能夠有效地殺傷腫瘤細胞。結(jié)論：BIRC5啟動子具有顯著的腫瘤特異性，能有效地啟動CD基因的表達，達到靶向性殺傷腫瘤細胞的作用。
獲獎情況
- 擬申請專利1項，投稿1篇。
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻
- 1,Huang R, Zhao Z, et al. Targeting of tumor radioiodine therapy by expression of the sodium iodide symporter under control of the survivin promoter. Cancer Gene Ther, 2011,18(2):144-52 2,Ma L, Yue W, et al. Clinical Significance and Diagnostic Value of Survivin Autoantibody in Non-small Cell Lung Cancer Patients. Zhongguo Fei Ai Za Zhi, 2010, 13(7):706-12 3,Sher YP, Tzeng TF, et al. Cancer targeted gene therapy of BikDD inhibits orthotopic lung cancer growth and improves long-term survival. Oncogene, 2009, 28(37):3286-95 4,唐友紅, 鐘美佐,等.人類生存蛋白啟動子的克隆及其在淋巴瘤細胞中的轉(zhuǎn)錄活性. 白血病?淋巴瘤,2010, 19(2):84-7 5,Chen JS, Liu JC. Cancer-specific activation of the survivin promoter and its potential use in gene therapy. Cancer Gene Ther, 2004, 11(11):740-7 6,Stolworthy TS, Korkegian AM, et al. Yeast cytosine deaminase mutants with increased thermostability impart sensitivity to 5-fluorocytosine. J Mol Biol, 2008, 377(3): 854-69 7,劉國彥,羅琪.CD/5-FC自殺基因體系對肝、膽、胰腫瘤細胞的殺傷作用及機制.世界華人消化雜志，2008,16(35):3946-52.
同類課題研究水平概述
- 當(dāng)前腫瘤基因治療研究中廣泛應(yīng)用的自殺基因主要有：單純皰疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）和胞嘧啶脫氨酶基因（CD）。胸腺激酶將GCV轉(zhuǎn)換成一種磷酸化的有毒代謝物（GCV-P）抑制DNA聚合酶，導(dǎo)致DNA鏈合成終止。CD將無毒的前藥5-氟胞嘧啶（5-FC）脫氨基轉(zhuǎn)化為有細胞毒性的化療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU），后者最終代謝產(chǎn)物FdUMP能抑制胸苷酸合酶，導(dǎo)致dTTP池的耗盡而最終抑制DNA的合成。CD/5-FC系統(tǒng)相較于HSV-TK/GCV系統(tǒng)有一定的潛在的優(yōu)勢：首先，CD/5-FC系統(tǒng)產(chǎn)生的5-FU已經(jīng)是臨床上常用的化療藥物；其次，CD/5-FC系統(tǒng)有更強的旁觀者效應(yīng)，GCV-P需要細胞間隙連接通訊來殺傷未轉(zhuǎn)化的臨近腫瘤細胞，然而細胞間隙連接通訊在腫瘤細胞中經(jīng)常缺失，而5-FU則無需間隙連接也能殺傷未轉(zhuǎn)化細胞。 目前關(guān)于利用自殺基因進行抗腫瘤的研究中，大多集中在通過CD和TK聯(lián)用，或者與放化療等手段聯(lián)用達到改進自殺基因殺傷效果的目的。通過腫瘤特異性的啟動子對自殺基因進行調(diào)控的研究還比較少，并且研究的不夠深入，如對前藥的轉(zhuǎn)化效率等具體機制涉及的不多。 關(guān)于BIRC5啟動子的研究，Bao R，Connolly DC 等人的研究結(jié)果表明，BIRC5基因啟動子可特異在腫瘤而非正常細胞內(nèi)促進報告基因的轉(zhuǎn)錄，活性高于SV40啟動子，說明腫瘤細胞中存在與正常細胞不同的轉(zhuǎn)錄因子譜，能特異激活BIRC5啟動子，而該啟動子在腫瘤細胞中啟動下游基因表達的能力并沒有組織或細胞特異性。Tang等對BIRC5啟動子在淋巴瘤細胞中的轉(zhuǎn)錄活性進行了研究，結(jié)果表明BIRC5啟動子在淋巴瘤細胞中具有較高的特異性。Chen等對BIRC5啟動子驅(qū)動Trail誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的進行研究，表明含該啟動子的重組質(zhì)粒在腫瘤細胞中能增強Trail蛋白的表達,并能誘導(dǎo)HepG2肝癌細胞凋亡。 就目前的研究進展來看，對于利用BIRC5啟動子調(diào)控CD基因進行靶向性抗腫瘤的研究還有待進一步加深，對相關(guān)的抗腫瘤效果和詳細機制還有待進一步的研究和探索。
