基本信息
- 項目名稱：
- 共軛亞油酸誘導小鼠脂肪肝的分子機制研究
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 本試驗通過給公鼠飼喂1.5%的共軛亞油酸，結果顯示：小鼠肝臟重量和肝臟的脂質(zhì)含量均顯著增加；肝臟細胞的胞漿內(nèi)呈現(xiàn)大量脂肪滴；血液中的轉氨酶ALT、AST、ALP的活性升高，同時T-CHO、HDL均顯著高于對照組（P＜0.05）；負責從肝外向肝內(nèi)轉運脂肪酸的CD36基因表達極顯著上調(diào)3.63倍（P<0.01），負責合成VLDL的APOB100基因表達顯著下調(diào)0.53倍（P＜0.05）。
- 詳細介紹：
- 選取24只健康4周齡小公鼠，隨機分為2組,每組12只。試驗組飼喂含1.5%CLA的飼料、對照組飼喂含1.5%花生油的飼料。本試驗采用剪趾標記法。 1 血液胰島素含量的檢測：將已飼喂20d的小鼠進行斷尾取血，200μl/只，放入加有10μl EDTA的Ep管中，以4℃/12000rpm/10min的條件離心，吸取上清，用胰島素放免試劑盒進行放免試驗。 2 胰島素耐受試驗（ITT）：做完放免試驗五天后，小鼠饑餓過夜，稱重、測定葡萄糖含量，記為0min,再按0.5μl/g劑量注射胰島素，分別于注射后3min、15min、30min、60min、90min、120min測定葡萄糖含量。 3 取組織：試驗最后一天，按10μl/g劑量小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，從腹主靜脈取約1ml血，放入加有10μl EDTA的Ep管中， 4℃/12000rpm/10min離心，取上清，凍存于-80℃待檢；完整取下肝臟，稱重后記錄，一部分放于多聚甲醛中，另一部分凍存于液氮中。 4 血液代謝分析：將血漿送到河南省中醫(yī)學院檢驗科檢測血液代謝變化。 5 肝臟脂質(zhì)含量分析：提取肝臟脂質(zhì)，然后采用甘油三酯試劑盒在自動生化分析儀上進行分析。 6 制備石蠟切片：取肝臟組織，經(jīng)固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片攤片、脫蠟、H.E.染色、脫水透明、封固等過程制作切片。 7 組織RNA提?。喝「闻K組織，用TRIZOL提取總RNA，通過凝膠電泳檢測RNA的完整性，以NanoDrop-1000 微量核酸載體檢測儀對提取的RNA進行純度檢驗并測量濃度。采用M-MLV反轉錄酶（Promega）把RNA反轉錄成cDNA。 8 熒光定量PCR：取不同時期肝臟組織的cDNA，10倍梯度稀釋,每個濃度重復三次, 在熒光定量PCR儀上進行反應，根據(jù)溶解曲線判斷產(chǎn)物特異性，計算CT值和擴增效率。 9 mRNA相對表達量的計算：以GAPDH基因為內(nèi)參（reference），通過公式對對照組和CLA組肝臟組織目的基因的mRNA相對表達量進行計算、分析。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：通過給小鼠飼喂一定劑量的共軛亞油酸（CLA），誘導小鼠形成脂肪肝，并觀察小鼠肝臟組織中基因表達的變化，探索CLA形成脂肪肝的機制。 思路：采用含一定劑量CLA的飼糧飼喂小鼠，檢測血液中胰島素含量，并做胰島素耐受試驗（ITT），測定肝臟重量和肝臟的脂質(zhì)含量，進行血液代謝分析，同時制作肝臟石蠟切片，并進一步分析肝臟組織基因表達變化，探討脂肪肝的形成機制。
科學性、先進性及獨特之處
- 作品先從小鼠的肝臟重量、血液指標等表觀數(shù)據(jù)研究脂肪肝的形成，再從肝臟基因表達變化等分子水平對脂肪肝的成因做進一步的探索，設計合理，研究手段先進。特別是發(fā)現(xiàn)CLA能使小鼠從肝外向肝內(nèi)轉運脂肪酸的CD36基因表達極顯著上調(diào)，表明脂肪酸轉運加強；而負責合成VLDL（向肝外轉運脂蛋白）的APOB100基因的表達顯著下調(diào)，表明肝臟向外轉運脂蛋白的能力受到限制，造成了肝臟的脂肪蓄積現(xiàn)象，這一點頗有意義。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 隨著現(xiàn)在人們生活水平的提高，在醫(yī)學實踐中胰島素抵抗、脂肪肝等代謝紊亂病的發(fā)病率越來越高，但其發(fā)病的分子機制還未明了。本試驗用CLA飼喂小鼠的方法，成功地誘導小鼠產(chǎn)生了胰島素抵抗和脂肪肝，并對其發(fā)生機制進行了探討。 本項目為揭示代謝性疾病的發(fā)病機制，并為篩選藥物干預脂肪肝形成打下了基礎。
學術論文摘要
- 通過在飼料中加入1.5%的CLA，發(fā)現(xiàn)能夠升高小鼠血液中胰島素的含量，同時肝臟重量和肝臟的脂質(zhì)含量均增加，小鼠形成脂肪肝。通過胰島素耐受試驗，發(fā)現(xiàn)CLA能夠誘導小鼠形成胰島素抵抗。通過制作肝臟組織石蠟切片，發(fā)現(xiàn)CLA能夠使肝臟細胞的細胞核被擠到邊緣或消失，胞漿內(nèi)呈現(xiàn)大量脂肪滴。通過血液代謝分析，發(fā)現(xiàn)血液中的轉氨酶ALT、AST、ALP的活性升高，同時T-CHO、HDL均顯著高于對照組（P＜0.05）。同時對肝臟組織的基因表達進行分析，發(fā)現(xiàn)CLA能夠使小鼠從肝外向肝內(nèi)轉運脂肪酸的CD36基因表達極顯著上調(diào)，而負責合成VLDL的APOB100基因的表達顯著下調(diào)，從而造成了肝臟的脂肪蓄積現(xiàn)象。
獲獎情況
- 無
鑒定結果
- 無
參考文獻
- [1] Wang YW,Jones PJH.Conjugated linoleic acid and obesity control:efficacy and mechanisms[J].International journal of obesity,2004,28:941-955. [2] West DB, Delany JP, Camet PM,et al.Effects of conjugated linoleic acid on body fat and energy metabolism in the mouse[J]. Am J Physiol, 1998, 275: 667-672. [3] Park Y, Storkson JM, Albright KJ,et al. Evidence that the trans-10, cis-12 isomer of conjugated linoleic acid induces body composition changes in mice[J]. Lipids,1999,34:235-241. [4] DeLany JP, BlohmF, Truett AA, et al. Conjugated linoleic acid rapidly reduces body fat content in mice without affecting energy intake[J]. Am J Physiol ,1999, 276: 1172-1179. [5] Tsuboyama-Kasaoka N, Takahashi M, Tanemura K, et al. Conjugated linoleic acid supplementation reduces adipose tissue by apoptosis and develops lipodystrophy in mice[J]. Diabetes, 2000, 49:1534-1542.
同類課題研究水平概述
- 1 CLA減少能量攝入和增加能量消耗 雖然很多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)日糧中添加CLA能夠減少生長動物的體重、脂肪儲存和體脂含量，這其中的調(diào)節(jié)機制仍然還有很多未知之處。一些試驗表明添加CLA能夠減少食物和能量的攝入，而一些其他試驗發(fā)現(xiàn)CLA對于食物和能量沒有任何影響。已經(jīng)有報道食物中添加CLA能夠導致動物機體脂肪儲存的減少，但是對能量攝入上的影響很少。多個研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在日糧中添加CLA后，即使在能量攝入方面沒有變化，機體的脂肪也有減少。從這些試驗的結果中可以看出可能有其他的機制在其中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。 2 CLA減少脂肪細胞大小 在體外的研究發(fā)現(xiàn)，與添加亞油酸相比，在3T3-L1前脂肪細胞中添加CLA能夠減少細胞甘油三酯的含量和脂肪細胞的體積，研究發(fā)現(xiàn)，在3T3-L1前脂肪細胞中添加t-10c-12CLA，6天后也減少了甘油三酯含量和脂肪細胞大小，因此脂肪組織重量的減少應該主要是由于脂肪細胞的體積減少所致，少量是由細胞數(shù)量的減少所致，這些推測已經(jīng)被體內(nèi)的動物試驗所證實。 3 CLA改變前脂肪細胞分化 脂肪細胞的分化主要是由于一些基因表達程序化的改變所介導的。一些調(diào)節(jié)因子，如C/EBP和PPAR家族控制著前脂肪細胞的分化過程，這兩類因子在前脂肪細胞分化到脂肪細胞的過程中發(fā)揮著重要作用。這些轉錄因子能夠調(diào)節(jié)一些基因的表達，包括葡萄糖轉移因子4（GLU4）、SCD，而這些基因現(xiàn)在已經(jīng)用于研究細胞分化和特殊的組織表達。3T3-L1前脂肪細胞是一個體外研究脂肪細胞分化和擴增模型。CLA在脂肪細胞中一個靶基因可能是C/EBPα，這個基因在3T3-L1細胞分化時高表達，但是在擴增時不表達。添加CLA以后已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠減少C/EBPα的表達。 4 CLA導致的胰島素抵抗 CLA導致的脂肪減少現(xiàn)象已經(jīng)獲得了很多的關注，其中CLA在多個小鼠模型中觀測到引起胰島素抵抗。CLA引起的胰島素抵抗可能是因為血液中瘦素含量的改變引起的。在多個動物模型中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CLA引起了血漿瘦素含量的減少。給公鼠在高脂日糧中添加0.25~1%CLA，能夠劑量依賴性的減少血液瘦素的含量。其他試驗還發(fā)現(xiàn)添加1%CLA后雄性大鼠血液瘦素含量和脂肪重量都有所減少。試驗還發(fā)現(xiàn)血液中瘦素的含量與腎周和睪丸的白色脂肪組織的重量有相關性。這些結果表明由CLA引起的脂肪組織的減少與瘦素含量降低有關，并且引發(fā)了胰島素抵抗。
