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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 胭脂魚低氧誘導(dǎo)因子(HIF-αs)的分子克隆和表達(dá)分析及其多態(tài)微衛(wèi)星的分離
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 獲得了胭脂魚的三個(gè)低氧誘導(dǎo)因子亞基，并且對其組織表達(dá)，胚胎發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)以及低氧-復(fù)氧處理的表達(dá)進(jìn)行了分析，構(gòu)建了胭脂魚的微衛(wèi)星文庫，開發(fā)了一系列引物。
- 詳細(xì)介紹：
- 中國胭脂魚（Myxocyprinus asiaticus）是長江特有的一種瀕危的淡水魚。低氧誘導(dǎo)因子（HIFs）是一種轉(zhuǎn)錄因子，本研究中分離了胭脂魚的三個(gè)亞基HIF-1α, HIF-2α和HIF-3α的cDNA全長，其cDNA全長分別是3890 bp、3230 bp和3374 bp，分別編碼780、782和632個(gè)氨基酸。通過實(shí)時(shí)熒光定量來分析三個(gè)亞基在不同組織和不同的胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量變化。短期低氧處理實(shí)驗(yàn)（2.2, 2.8和3.2 mg/L的溶氧分別處理24小時(shí)）增加了HIF-1α和HIF-3α的mRNA表達(dá)水平，并且隨著氧濃度的降低表達(dá)量會(huì)增加。在所有處理的條件下HIF-2α的表達(dá)水平都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于另外兩個(gè)亞基。本研究也首先使用包含重要的低氧降解結(jié)構(gòu)域ODD結(jié)構(gòu)域的一個(gè)區(qū)域來區(qū)分鯉科魚類中的低氧敏感和低氧耐受的魚，在固定區(qū)域中的絲氨酸數(shù)目小于40時(shí)就是低氧敏感的魚類，反之則是低氧耐受的魚。研究還分離和鑒定了14個(gè)新的胭脂魚多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)，分別來自于(CA)n和(GA)n的微衛(wèi)星富集文庫。每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)目從6個(gè)到14個(gè)，觀測雜合度（HO）和期望雜合度（HE）的變化范圍分別是0.120-1.000和0.767-0.947。其中有五個(gè)位點(diǎn)顯著的偏離哈迪-溫伯格平衡。本文的創(chuàng)新點(diǎn)是多態(tài)的微衛(wèi)星位點(diǎn)和HIF的研究為胭脂魚的人工繁殖和遺傳結(jié)構(gòu)分析提供了理論指導(dǎo)，有利于其種群資源的恢復(fù)。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：胭脂魚是國家二級保護(hù)動(dòng)物，然而由于人類活動(dòng)的參與使得其野生群體數(shù)目急劇下降。對低氧誘導(dǎo)因子以及微衛(wèi)星的研究有利于人工養(yǎng)殖。 基本思路：通過設(shè)計(jì)兼并引物獲得HIF-1α/2α/3α部分序列再設(shè)計(jì)特異引物，利用RACE技術(shù)獲得cDNA全長，通過qRT-PCR分析時(shí)空表達(dá)。另外構(gòu)建了微衛(wèi)星文庫，鑒定了14對微衛(wèi)星引物。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 科學(xué)性：本研究使用隨機(jī)大群體排除誤差，微衛(wèi)星引物嚴(yán)格篩選，保證其有效性，選擇多個(gè)參照基因以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。 先進(jìn)性：通過RACE技術(shù)獲得胭脂魚的HIF-1α/2α/3α，使用qRT-PCR對其時(shí)空表達(dá)普進(jìn)行分析。另外使用磁珠富集法分離了的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，并對群體做PAGE檢測。 特色：分離中國的特有種胭脂魚的三個(gè)HIF亞基，分離其微衛(wèi)星引物。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 應(yīng)用價(jià)值：低氧調(diào)節(jié)因子的獲得可以為人工養(yǎng)殖胭脂魚在氧消耗方面提供理論基礎(chǔ)。微衛(wèi)星技術(shù)可以為進(jìn)一步研究胭脂魚遺傳多樣性、種群遺傳結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。 現(xiàn)實(shí)意義：HIF-αs的獲得有助于研究魚類低氧應(yīng)激的分子調(diào)控機(jī)制；微衛(wèi)星技術(shù)可用于篩選優(yōu)良性狀的親本進(jìn)行人工繁殖。兩種技術(shù)結(jié)合的應(yīng)用就是在胭脂魚的人工養(yǎng)殖中。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 中國胭脂魚（Myxocyprinus asiaticus）是長江特有的一種瀕危的淡水魚。低氧誘導(dǎo)因子（HIFs）是一種轉(zhuǎn)錄因子，本研究中分離了胭脂魚的三個(gè)亞基HIF-1α, HIF-2α和HIF-3α的cDNA全長，其cDNA全長分別是3890 bp、3230 bp和3374 bp，分別編碼780、782和632個(gè)氨基酸。通過實(shí)時(shí)熒光定量來分析三個(gè)亞基在不同組織和不同的胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量變化。短期低氧處理實(shí)驗(yàn)（2.2, 2.8和3.2 mg/L的溶氧分別處理24小時(shí)）增加了HIF-1α和HIF-3α的mRNA表達(dá)水平，并且隨著氧濃度的降低表達(dá)量會(huì)增加。在所有處理的條件下HIF-2α的表達(dá)水平都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于另外兩個(gè)亞基。本研究也首先使用包含重要的低氧降解結(jié)構(gòu)域ODD結(jié)構(gòu)域的一個(gè)區(qū)域來區(qū)分鯉科魚類中的低氧敏感和低氧耐受的魚。研究還分離和鑒定了14個(gè)新的胭脂魚多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)目從6個(gè)到14個(gè)，觀測雜合度（HO）和期望雜合度（HE）的變化范圍分別是0.120-1.000和0.767-0.947。其中有五個(gè)位點(diǎn)顯著的偏離哈迪-溫伯格平衡。本文的創(chuàng)新點(diǎn)是多態(tài)的微衛(wèi)星位點(diǎn)和HIF的研究為胭脂魚的人工繁殖和遺傳結(jié)構(gòu)分析提供了理論指導(dǎo)，有利于其種群資源的恢復(fù)。
獲獎(jiǎng)情況
- Isolation of polymorphic microsatellite loci from an endangered freshwater species Chinese sucker, Myxocyprinus asiaticus. Conservation Genetics Resources, 2010, 2, 73-75
鑒定結(jié)果
- 作品真實(shí)有效，作者本人承擔(dān)了大部分研究。已發(fā)表的以及正在發(fā)表的論文均是相關(guān)實(shí)驗(yàn)的成果，作者本人均為第一作者。
參考文獻(xiàn)
- 1.Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci from a dinucleotide-enriched genomic library of obscure puffer (Takifugu obscurus) and cross-species amplification. Conserv Genet (2009) 10:955–957 2.Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci from Yellowcheek (Elopichthys bambusa). Conserv Genet (2009) 10 (6): 1811-1813 3.HIF-1α and -2α genes in a hypoxia- sensitive teleost species Megalobrama amblycephala: cDNA cloning, expression and different responses to hypoxia. Comparative Biochemistry and Physiology Part B (2010) (3):273-280 4.Molecular cloning, characterization and expression of two hypoxia-inducible factor alpha subunits, HIF-1α and HIF-2α, in a hypoxia-tolerant marine teleost, Atlantic croaker (Micropogonias undulatus). Gene (2007) 2:273-282
同類課題研究水平概述
- HIF-1是低氧誘導(dǎo)結(jié)合蛋白，是一種堿基—螺旋—環(huán)—螺旋PAS異二聚蛋白質(zhì)，有α 、β兩個(gè)亞基構(gòu)成。研究認(rèn)為HIF-1是誘導(dǎo)低氧基因和修復(fù)細(xì)胞氧內(nèi)環(huán)境的一核心調(diào)節(jié)因子。氧直接與氧感受器相互作用與線粒體呼吸無關(guān)，保持氧感受器處于失活狀態(tài)；氧減少時(shí)氧感受器激活一種信號，經(jīng)蛋白磷酸化及/或氧化還原，導(dǎo)致HIF-1/β表達(dá)升高，復(fù)氧后減少。據(jù)報(bào)道，在低氧條件下，很多基因受到低氧誘導(dǎo)因子的調(diào)控。在陸地動(dòng)物中，尤其是在人和大鼠中低氧誘導(dǎo)因子研究較多，因?yàn)槠渑c某些疾病是緊密相連的。在魚類中國內(nèi)外都有研究，但由于魚的種類較多其研究的深度不夠。本研究也只是得到了其cDNA全長序列，對其時(shí)空表達(dá)進(jìn)行了分析，為以后更深入的研究奠定了基礎(chǔ)。 微衛(wèi)星(microsatellite)DNA標(biāo)記又稱SSR ( simple sequence repeats)標(biāo)記或STR ( simple tandem repeat)標(biāo)記，是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸( 1～6 個(gè))為單位多次重復(fù)的簡單序列，是近年來發(fā)展起來的新一代分子標(biāo)記技術(shù)。 微衛(wèi)星存在于大多數(shù)生物的基因組中，被廣泛的應(yīng)用于遺傳雜交育種和繪制染色體遺傳圖譜等領(lǐng)域。本研究主要是開發(fā)了中國特有的國家二級保護(hù)動(dòng)物胭脂魚的微衛(wèi)星引物，我國已有學(xué)者通過RAPD、 PCR - RFLP和線粒體等標(biāo)記技術(shù)對中國胭脂魚的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步的探討,但得到的多態(tài)性引物較少。也有學(xué)者對美國Deltistes luxatus上開發(fā)的引物對中國胭脂魚進(jìn)行試驗(yàn)，但是僅有少數(shù)引物能夠與胭脂魚共享。目前已知的僅有楊鐘開發(fā)的18對胭脂魚微衛(wèi)星引物。由于過度捕撈、水域污染、水利工程建設(shè)等人為因素的影響，胭脂魚的資源量已經(jīng)急劇下降，作為我國和亞洲大陸唯一分布的單型屬、種，對其進(jìn)行保護(hù)刻不容緩。本研究開發(fā)了14對胭脂魚微衛(wèi)星引物，并對引物的有效性進(jìn)行了檢驗(yàn)。以此希望能夠應(yīng)用于胭脂魚遺傳多樣性、種群遺傳結(jié)構(gòu)等進(jìn)一步研究及人工增殖放流效果評估。
