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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 重組農(nóng)桿菌質(zhì)?？焖勹b定方法
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 大類：
- 科技發(fā)明制作A類
- 簡介：
- 目的：根據(jù)堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA的原理，經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)摸索獲得一種快速、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的重組子鑒定方法。 方法：本研究通過溶菌酶和煮沸法結(jié)合的方法提取重組農(nóng)桿菌的質(zhì)粒利用瓊脂糖凝膠電泳鑒別重組子，再通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)鑒定結(jié)果。 結(jié)論:經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明溶菌酶和煮沸法相結(jié)合的方法是篩選農(nóng)桿菌重組子的一種簡單易行、經(jīng)濟(jì)方便、快速穩(wěn)定、提高工作效率的方法，其靈敏性和重復(fù)性較好,適合在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室推廣。
- 詳細(xì)介紹：
- 實(shí)驗(yàn)方法： 1.分別挑取轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中的單菌落，以及未經(jīng)轉(zhuǎn)化的空質(zhì)粒作為對照，分別接種于3ml的含有抗生素的LB培養(yǎng)液中，26.5℃，160r/min，培養(yǎng)12-16h，培養(yǎng)至OD600為1.0-1.2。 2.1.2ml菌液加入到1.5ml Eppendoff管中。 3. 4℃，12000r/min，離心1-2min，棄上清，收集菌體。 4.棄去上清液，用無菌濾紙吸干菌體的殘留液體。 5. 取10ul溶液I，用移液器反復(fù)抽吸混勻，并用渦輪混合儀充分混勻。 6.加入5ul溶菌酶，用移液器充分混勻。 7. 室溫放置3min。 8.放入沸水中1min后取出。 9. 4℃，12000r/min，離心10min。 10.取出10ul上清液點(diǎn)樣，0.8%瓊脂糖凝膠電泳100v 40min后觀察結(jié)果，對重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒進(jìn)行區(qū)分。 11. 重組子得PCR鑒定 對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測，準(zhǔn)確地鑒別陽性克隆。
作品圖片
作品專業(yè)信息
設(shè)計(jì)、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點(diǎn)、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)
- 目的：根據(jù)堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA的原理，經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)摸索獲得一種快速、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的重組子鑒定方法。 基本思路：本研究通過溶菌酶和煮沸法相結(jié)合的方法提取重組農(nóng)桿菌的質(zhì)粒利用瓊脂糖凝膠電泳鑒別重組子，再通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)鑒定結(jié)果。 創(chuàng)新點(diǎn):將溶菌酶和煮沸法相結(jié)合快速穩(wěn)定的鑒別農(nóng)桿菌重組子。 技術(shù)關(guān)鍵：在本研究中，通過多次實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，以及堿裂解法與煮沸法的啟發(fā)，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)摸索創(chuàng)造出一種快速、方便和經(jīng)濟(jì)的重組農(nóng)桿菌質(zhì)粒鑒定方法。 主要技術(shù)指標(biāo)：該法只需要在極短時(shí)間內(nèi)提取出質(zhì)粒，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，可以初步快速的篩選出重組子，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，準(zhǔn)確鑒定陽性克隆，極大地提高了篩選克隆的工作效率。而且經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，在不同的宿主間比較該方法穩(wěn)定、方便。
科學(xué)性、先進(jìn)性
- 在分子克隆和以農(nóng)桿菌為介導(dǎo)進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中重組農(nóng)桿菌的質(zhì)粒提取和純度鑒定是一項(xiàng)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)操作，質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)化成功對后續(xù)實(shí)驗(yàn)有著重要影響經(jīng)典的提取質(zhì)粒DNA的方法主要包括煮沸裂解法、SDS堿裂解法以及氯化銫密度梯度離心等。比較常用的質(zhì)粒DNA提取方法主要包括堿裂解法、Mini質(zhì)粒提取等?；谵r(nóng)桿菌細(xì)胞的特殊性,一般在提取時(shí)需要加入一定量的裂解酶,并在提取后需要用酚、氯仿等進(jìn)行純化處理。這些方法盡管具有純度較高的優(yōu)點(diǎn),但操作過程較復(fù)雜繁瑣,且所使用的藥品多對操作人員有直接或間接的危害。雖然有的實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)過很多質(zhì)?？焖偬崛〉姆椒ǎ沁^程繁瑣，需要的試劑也很多，有部分試劑危害性較大。本研究結(jié)合了溶菌酶和煮沸法提取的優(yōu)點(diǎn),簡化操作流程和嚴(yán)格反應(yīng)環(huán)境條件,使農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的提取量及純度得到了大幅度提高, 縮短操作時(shí)間,并且由于操作過程中避免使用酚、氯仿等對人體有害的試劑,使實(shí)驗(yàn)本身對操作者的危害得以降低。應(yīng)用本方法為開展一般的分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
獲獎情況及鑒定結(jié)果
- 2011年4月15日根據(jù)專利法第28條及其實(shí)施細(xì)則第38條、第39條的規(guī)定，申請人提出的專利申請已由國家知識產(chǎn)權(quán)局受理。 申報(bào)號： 201110094634.4 申報(bào)日期 2011年04月15日
作品所處階段
- 實(shí)驗(yàn)室階段
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
- 專利
作品可展示的形式
- 圖片
使用說明,技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢,適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說明,市場分析,經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測
- 本研究結(jié)合了溶菌酶和煮沸法提取的優(yōu)點(diǎn),簡化操作流程和嚴(yán)格反應(yīng)環(huán)境條件,使農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的提取量及純度得到了大幅度提高, 縮短操作時(shí)間,并且由于操作過程中避免使用酚、氯仿等對人體有害的試劑,使實(shí)驗(yàn)本身對操作者的危害得以降低。本方法可以在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用。
同類課題研究水平概述
- 國外報(bào)道過Sambrook J,Russell DW利用煮沸裂解法、SDS堿裂解法以及氯化銫密度梯度離心等方法對質(zhì)粒的提取的進(jìn)行不同程度的改進(jìn)，但是都面臨耗時(shí)較長，所用危險(xiǎn)試劑較多，且很昂貴的問題[1]。 國內(nèi)有相關(guān)報(bào)道，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所基因工程實(shí)驗(yàn)室的崔洪志、郭三堆，湖北師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院的王友如等利用常規(guī)堿裂解與Mini質(zhì)粒提取相結(jié)合的方法，加大菌液使用量，利用LiCl 離心沉淀DNA，嚴(yán)格限制反應(yīng)的環(huán)境條件，使操作流程簡化，并去除了酚、氯仿等有害試劑[2]，但使用的LiCl 價(jià)格昂貴，代價(jià)高；新鄉(xiāng)學(xué)院的豐貴鵬、彭芳對農(nóng)桿菌質(zhì)粒提取進(jìn)行了不通過因素的比較分析，采用堿裂解法Mini提取法相結(jié)合，并增加了酚氯仿抽提的次數(shù)，雖然結(jié)果上有所提高，但是增加例如化學(xué)試劑的使用次數(shù)，危險(xiǎn)性較大[3]；福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院單世華、李春娟、張君誠等以農(nóng)桿菌菌株LBA4404(A?tumefaciens)為載體，以雙價(jià)表達(dá)載體pCGⅡ?yàn)檠芯繉ο?，運(yùn)用堿裂解法和Mini 質(zhì)粒提取的優(yōu)點(diǎn)，提高提取試劑的純度、增加菌液收集量，通過把簡化操作流程與嚴(yán)格限制反應(yīng)的環(huán)境條件相結(jié)合，使農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA 的提取量大幅增加[4]，但該方法在提取的過程中復(fù)性和離心純化等步驟用時(shí)過長。 [1] Sambrook J,Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rded. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, pp.26-66. [2] 王友如，崔洪志，郭三堆．農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA提取方法的優(yōu)化[J]．生物技術(shù)，2005，15(4)：41-43． [3] 豐貴鵬，彭芳. 農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA高效提取方法研究[J].新鄉(xiāng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010, 27(2): 48-51. [4] 單世華，李春娟，張君誠，等．農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA提取方法的改良與鑒定[J]．生物技術(shù)，2003，13(2)：19-20．
