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基本信息

項(xiàng)目名稱：
溫敏β-環(huán)糊精衍生物用于蛋白質(zhì)復(fù)性的研究
小類：
能源化工
簡(jiǎn)介：
用溫敏化合物聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPA-COOH）改性β-環(huán)糊精，考察改性產(chǎn)物對(duì)變性溶菌酶的復(fù)性效率及復(fù)性機(jī)理。結(jié)果表明：改性產(chǎn)物對(duì)鹽酸胍變性溶菌酶的復(fù)性具有抑制作用，但對(duì)尿素變性溶菌酶的復(fù)性具有促進(jìn)作用；熒光光譜實(shí)驗(yàn)證實(shí)改性產(chǎn)物分子中的環(huán)糊精空腔與PNIPA鏈段可以同時(shí)促進(jìn)溶菌酶的復(fù)性。
詳細(xì)介紹：
環(huán)糊精和溫敏聚合物聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPA)對(duì)蛋白質(zhì)的復(fù)性均有良好的促進(jìn)作用。本研究將氨基-β-環(huán)糊精（EDA-β-CD）和帶末端羧基的聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPA-COOH）偶聯(lián)得到了一種溫敏β-環(huán)糊精衍生物(β-CD-PNIPA)，分別考察其在不同變性體系、不同β-CD-PNIPA濃度、不同復(fù)性溫度以及在表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）存在下對(duì)溶菌酶的復(fù)性效果；通過(guò)與EDA-β-CD和PNIPA-COOH的對(duì)比分析，揭示了β-CD-PNIPA分子中的環(huán)糊精空腔與PNIPA鏈段的協(xié)同作用，并使用熒光光譜法進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：β-CD-PNIPA對(duì)鹽酸胍變性溶菌酶的復(fù)性具有抑制作用，但對(duì)尿素變性溶菌酶的復(fù)性具有促進(jìn)作用；在常溫下，0.4mg/mL的β-CD-PNIPA可使1 mg/mL溶菌酶的復(fù)性率增加至83.7%，而直接稀釋法僅為55.8%；β-CD-PNIPA對(duì)溶菌酶的復(fù)性溫度應(yīng)略小于β-CD-PNIPA的相轉(zhuǎn)變溫度（LCST，33.6℃），高于這一溫度時(shí)會(huì)由于β-CD-PNIPA發(fā)生相變而導(dǎo)致溶菌酶的復(fù)性率急劇降低。在輔助溶菌酶復(fù)性的過(guò)程中，β-CD-PNIPA分子中的環(huán)糊精空腔與PNIPA鏈段可以同時(shí)促進(jìn)溶菌酶的復(fù)性，熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一結(jié)論。

作品專業(yè)信息

撰寫目的和基本思路

目的：探索溫度敏感型環(huán)糊精對(duì)天然蛋白質(zhì)（溶菌酶）的復(fù)性效率及復(fù)性機(jī)理。思路：將經(jīng)過(guò)溫敏化合物聚(N-異丙基丙烯酰胺)改性后的β-環(huán)糊精用于溶菌酶的復(fù)性，通過(guò)比較本研究中制備的EDA-CD、PNIPA-COOH和β-CD-PNIPA對(duì)于溶菌酶復(fù)性的影響考察β-CD-PNIPA單獨(dú)用于溶菌酶復(fù)性的可能性，并采用熒光光譜法研究了β-CD-PNIPA與溶菌酶的相互作用機(jī)理。

科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處

1.將具有環(huán)境響應(yīng)型的β-環(huán)糊精單獨(dú)作為人工分子伴侶直接輔助用于溶菌酶的復(fù)性，這是以往的研究較少涉足的。 2.將三種不同類型的β-環(huán)糊精與表面活性劑組成人工分子伴侶系統(tǒng)，探討在溶菌酶的復(fù)性過(guò)程中二者的協(xié)同作用。 3.采用圓二色譜法及熒光光譜法研究溶菌酶的復(fù)性過(guò)程，探討在復(fù)性過(guò)程中β-環(huán)糊精的存在對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，并分析溶菌酶的復(fù)性動(dòng)力學(xué)過(guò)程，探索其折疊機(jī)理。

應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義

本作品著眼于當(dāng)前生物化學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)——蛋白質(zhì)復(fù)性中存在的一些問(wèn)題，合成了一種新型的功能型的環(huán)糊精衍生物用于變性蛋白質(zhì)的復(fù)性，在一定程度上解決了在傳統(tǒng)蛋白質(zhì)復(fù)性研究中復(fù)性收率普遍較低以及復(fù)性完成后復(fù)性劑與蛋白質(zhì)的分離問(wèn)題。從研究結(jié)果來(lái)看，達(dá)到了研究者的設(shè)計(jì)要求，具有較高的實(shí)際應(yīng)用和推廣價(jià)值。

學(xué)術(shù)論文摘要

用溫敏化合物聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPA-COOH）改性β-環(huán)糊精，通過(guò)評(píng)估β-CD-PNIPA、EDA-CD和PNIPA-COOH對(duì)經(jīng)尿素變性的溶菌酶的復(fù)性效果，從而證實(shí)是否可將β-CD-PNIPA單獨(dú)用于輔助蛋白質(zhì)復(fù)性。結(jié)果顯示，加入EDA-CD、PNIPA-COOH或β-CD-PNIPA后，溶菌酶復(fù)性率均高于直接稀釋時(shí)溶菌酶的復(fù)性率。特別地，單獨(dú)加入β-CD-PNIPA時(shí)溶菌酶的復(fù)性率最高，但略低于將β-CD-PNIPA和CTAB按最佳順序加入到復(fù)性液中時(shí)。最好在低于β-CD-PNIPA的Lower critical solution temperature（LCST）的溫度條件下將β-CD-PNIPA用于輔助蛋白質(zhì)復(fù)性。β-CD-PNIPA與溶菌酶的相互作用是通過(guò)熒光發(fā)射光譜表征的。基于以上結(jié)果，β-CD-PNIPA可單獨(dú)用于輔助蛋白質(zhì)復(fù)性，也可與CTAB聯(lián)合用于輔助蛋白質(zhì)復(fù)性。加入β-CD-PNIPA后溶菌酶的復(fù)性得到了改進(jìn)，這是因?yàn)棣?CD空穴對(duì)溶菌酶分子具有包絡(luò)作用以及溶菌酶分子與PNIPA片段間存在疏水作用。

獲獎(jiǎng)情況

我校課外學(xué)術(shù)科技節(jié)一等獎(jiǎng) 我省青年學(xué)術(shù)科技節(jié)一等獎(jiǎng)

鑒定結(jié)果

無(wú)

參考文獻(xiàn)

（1）β-環(huán)糊精的溫敏改性技術(shù)檢索文獻(xiàn)：T. Nozaki, Y. Maeda, K. Ito, H. Kitano, Cyclodextrins Modified with Polymer Chains Which Are Responsive to External Stimuli, Macromolecules, 1996, 285: 22-524. （2）溶菌酶變性技術(shù)檢索文獻(xiàn)：A. Desai, C. Lee, L. Sharma, A. Sharma, Lysozyme renaturation with cyclodextrins: structure– activity relationship, Biochimie, 2006, 88: 1435–1445. （3）溶菌酶活性的測(cè)定技術(shù)檢索文獻(xiàn)：P. Jolles, Preparation and assay of enzymes. Meth. Enzymol, 1962, 5: 12–13.

同類課題研究水平概述

由于環(huán)糊精分子中含有疏水性空腔，客體分子能從寬口端進(jìn)入其分子空腔形成包絡(luò)化合物。因此在使用表面活性劑輔助蛋白質(zhì)復(fù)性時(shí)，常常需要加入環(huán)糊精以剝離與蛋白質(zhì)形成膠束的表面活性劑或去污劑。Karuppiah等人發(fā)現(xiàn)，向鹽酸胍變性的碳酸脫水酶(CAB)復(fù)性稀釋液中加入適量β-環(huán)糊精(β-CD)可使其復(fù)性率超過(guò)90%。他們認(rèn)為這是由于環(huán)糊精的疏水性空腔與蛋白質(zhì)復(fù)性中間體的疏水性位點(diǎn)發(fā)生了相互作用。聚(N-異丙基丙烯酰胺) (PNIPA )是一種具有溫度敏感性的聚合物，其相轉(zhuǎn)變溫度(Lower critical solution temperature，LCST)在32 ℃附近。Lin等人曾將PNIPA用于輔助β-lactamase的復(fù)性，發(fā)現(xiàn)其復(fù)性效率比PEG更高，使用PNIPA可使經(jīng)鹽酸胍變性的β-lactamase的活性率提高41％，而PEG只能提高26％。Lu等人曾采用SDS–PAGE, 圓二色譜和熒光光譜等方法研究了PNIPA對(duì)尿素變性溶菌酶的復(fù)性機(jī)理，認(rèn)為PNIPA對(duì)溶菌酶的復(fù)性作用是因?yàn)镻NIPA增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)并抑制了溶菌酶的聚集作用，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的復(fù)性。將β-CD與PNIPA耦聯(lián)，制備具有溫度敏感的β-環(huán)糊精衍生物(β-CD-PNIPA)主要被用于藥物釋放系統(tǒng)的研究。雖然Lu等人曾將該體系用于溶菌酶的復(fù)性，但偶聯(lián)產(chǎn)物中的β-CD結(jié)構(gòu)單元主要用于剝離表面活性劑CTAB，而未考察其對(duì)溶菌酶的復(fù)性作用。結(jié)合Karuppiah等人的研究，我們認(rèn)為，β-CD-PNIPA用于輔助蛋白質(zhì)復(fù)性時(shí)，其分子中PNIPA鏈段及環(huán)糊精的疏水性空腔應(yīng)當(dāng)可以同時(shí)促進(jìn)溶菌酶的復(fù)性，即具有協(xié)同輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的作用。
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