基本信息
- 項目名稱：
- 石斑魚抗菌肽的分離純化及其活性分析
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 利用致病性哈氏弧菌經(jīng)腹腔注射對布氏石斑魚進行誘導刺激，其頭腎粗提物具有較好的抑菌活性。利用電泳凝膠瓊脂糖彌散法檢測發(fā)現(xiàn)，頭腎粗提物中含有多種對大腸桿菌D31有較強抑制作用的蛋白類抗菌物質(zhì)；切膠回收AU-PAGE凝膠上的抗菌組分，利用SDS-PAGE凝膠檢測各抗菌活性組分的分子量，利用491制備型電泳槽對布氏石斑魚頭腎粗提物進行分離純化。
- 詳細介紹：
- 石斑魚是海南水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要對象，隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴大，養(yǎng)殖病害日益嚴重?？股赜心退幮?，藥物殘留等缺點，因此選擇對抗菌肽的研究來提高養(yǎng)殖質(zhì)量。而石斑魚抗菌肽的分離純化研究較少，主要集中在基因克隆方面的研究，因此我們選擇布氏石斑魚作為研究對象。利用致病性哈氏弧菌（Vibrio harveyi）經(jīng)腹腔注射對布氏石斑魚（Epinephelus bleekeri）進行誘導刺激18h，其頭腎粗提物具有較好的抑菌活性，不僅可抑制金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)等革蘭氏陽性菌，也可抑制大腸桿菌D31（Escherichia coli D31）、哈氏弧菌和溶藻弧菌(V. alginolyticus)等革蘭氏陰性菌；利用電泳凝膠瓊脂糖彌散法檢測發(fā)現(xiàn)，頭腎粗提物中含有多種對大腸桿菌D31有較強抑制作用的蛋白類抗菌物質(zhì)；切膠回收AU-PAGE凝膠上的抗菌組分，利用SDS-PAGE凝膠檢測各抗菌活性組分的分子量大小依次約為10.9KD、10.0KD、8.1KD、7.2KD、6.3KD，利用491制備型電泳槽對布氏石斑魚頭腎粗提物進行分離純化，其效果要優(yōu)于一般使用的層析法分離抗菌肽的方法，為為今后利用高壓液相色譜進行分離純化奠定了良好的基礎。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 撰寫目的：本作品選取海南經(jīng)濟養(yǎng)殖品種布氏石斑魚作為研究對象，旨在從頭腎分離得到新型抗菌肽，為后期新型藥物開發(fā)，控制病害提供依據(jù)。 基本思路：從布氏石斑魚頭腎分離得到粗提物，進行抗菌活性檢測及活性物質(zhì)性質(zhì)分析，確定為蛋白類活性物質(zhì)后，通過AU-PAGE電泳和SDS-PAGE電泳進行純化和分子量測定；同時粗提物進行491制備型電泳槽分離純化的探索，希望為今后抗菌肽的提取提供新的方法。
科學性、先進性及獨特之處
- 科學性：實驗設計過程參考并總結(jié)了大量國內(nèi)外相關文獻，實驗步驟相互驗證。先進性：石斑魚是我國南方重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖品種。但有關其抗菌肽等抗菌蛋白類物質(zhì)的研究并不多。大部分石斑魚抗菌肽的研究都集中在基因克隆方面，特別是布氏石斑魚在分離提取方面的研究少有報道。獨特之處：在抗菌肽的分離中，使用491制備型電泳槽進行抗菌肽的分離提純，比傳統(tǒng)使用的層析法效果更好，目前在國內(nèi)使用此方法的并不多。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 抗菌肽是被認為是最有可能替代現(xiàn)有抗生素用于疾病防治的新型抗菌藥物。在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害防治方面具有巨大的應用前景。本研究結(jié)果不僅有助于揭示石斑魚的免疫機制，為控制其病害探索合適方法，還有助于從石斑魚中發(fā)現(xiàn)具有較強活性的新型抗菌肽類，擴展整個魚類抗菌肽的研究深度和廣度，從而為研究具有良好活性且具有開發(fā)應用前景的病害控制新藥奠定基礎，并推動具有自主知識產(chǎn)權的新型抗感染藥物和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
學術論文摘要
- 利用致病性哈氏弧菌（Vibrio harveyi）經(jīng)腹腔注射對布氏石斑魚（Epinephelus bleekeri）進行誘導刺激18h，其頭腎粗提物具有較好的抑菌活性，不僅可抑制金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)等革蘭氏陽性菌，也可抑制大腸桿菌D31（Escherichia coli D31）、哈氏弧菌和溶藻弧菌(V. alginolyticus)等革蘭氏陰性菌；利用電泳凝膠瓊脂糖彌散法檢測發(fā)現(xiàn)，頭腎粗提物中含有多種對大腸桿菌D31有較強抑制作用的蛋白類抗菌物質(zhì)；切膠回收AU-PAGE凝膠上的抗菌組分，利用SDS-PAGE凝膠檢測各抗菌活性組分的分子量大小依次約為10.9KD、10.0KD、8.1KD、7.2KD、6.3KD，利用491制備型電泳槽對布氏石斑魚頭腎粗提物進行分離純化，未達到很好的分離效果，其分離條件尚需進一步優(yōu)化。
獲獎情況
- 省級“挑戰(zhàn)杯”全國大學生課外學術科技作品競賽二等獎
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻
- [1] OREN Z, SHAI Y. A class of highly potent antibacterial peptides derived from pardaxin, a pore-forming peptide isolated from Moses sole fish Pardachirus marmoratus [J]. European Journal of Biochemisty, 1996, 237:303~310. [2] PAN C Y, CHEN J Y, NI I H. et al. Organization and promoter analysis of the grouper (Epinephelus coioides) epinecidin-1 gene [J]. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B,2008,150: 358–367. [3] VEGA E, O’LEARY N A, SHOCKEY J E, et al. Anti-lipopolysaccharide factor in Litopenaeus vannamei (LvALF): A broad spectrum antimicrobial peptide essential for shrimp immunity against bacterial and fungal infection [J]. Molecular Immunology, 2008,45:1916-1925.. [4] SILPHADUANG U, NOGA E J. 2001. Antimicrobials: Peptide antibiotics in mast cells of fish [J]. Nature, 414: 268-269. [5] PANYIM S, CHALKLEY R. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histone [J]. Archives of Biochemisty and Biophysics,1969,130:337.
同類課題研究水平概述
- 自上世紀八、九十年代以來，相關人員主要采用分離純化和測序的模式得到了約20多種的魚類抗菌肽，主要有泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）的misgurin，美洲擬鰨（Pleuronecte americanus）的piscidins和Bass hepcidin，豹鰨（Pardachirus marmoratus）的pardaxins，斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）的HbβP，鯉魚（Cyprimus carpio）的糖基化抗菌肽等(Park et al,1997; Cole et al,1997; Lemaitre et al,1996; Oren et al,1996)。隨著分子生物學技術的不斷成熟，研究人員采用分子生物學的技術手段進行魚類抗菌肽的基因克隆相關研究，至今已從幾十種魚類克隆到相當豐富的抗菌肽同源基因。斑點叉尾鮰（I. punctatus）的NK-lysin，真鯛（Chrysophrys major）、南極魚（Dissostichus mawsoni）等多種魚類的hepcidin，斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）的epinecidin-1等(Chen et al. 2005; Wang et al,2006; Yin et al. 2006; Xu et al. 2008)。目前廣泛采用的包括cDNA末端快速擴增（RACE）技術、cDNA文庫構建和EST序列測定等分子生物學技術在對魚類各種同源基因的鑒定方面有著非常大的作用，但對新型魚類抗菌肽的鑒定仍有點力不從心。所以對于新型魚類抗菌肽還必須采用傳統(tǒng)的分離純化和測序模式來進行?？咕牡姆蛛x純化，目前常用的是先用層析系統(tǒng)初分，再用高壓液相色譜（HPLC）進一步純化，但用層析系統(tǒng)存在一個顯著缺陷，即容易丟失含量較少和分子量較小的成分，而這類抗菌肽往往活性高、易合成，開發(fā)潛力大。美國北卡州立大學Noga教授實驗室對層析系統(tǒng)和491制備型電泳槽分離抗菌肽效果的比較研究表明，后者能更好地保存樣品中的活性成分，可有效避免活性成分丟失的問題，更容易分離獲得魚類的新型抗菌肽。本文即采用該方法對石斑魚的抗菌肽進行分離純化，期望從石斑魚中發(fā)現(xiàn)具有較強活性的新型抗菌肽類，為研究具有良好活性且具有開發(fā)應用前景的病害控制新藥奠定基礎，具有重要的理論和實際意義。
