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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 人骨形態(tài)發(fā)生蛋白4成熟肽序列在畢赤酵母中的高效表達(dá)、純化和活性檢測(cè)
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 根據(jù)畢赤酵母高表達(dá)基因?qū)μ囟艽a子偏好的特性，選擇畢赤酵母高表達(dá)基因偏好的密碼子，替換人BMP-4成熟肽序列在畢赤酵母高表達(dá)基因中不常用的密碼子，優(yōu)化設(shè)計(jì)人BMP-4成熟肽表達(dá)序列并構(gòu)建重組表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌和篩選高表達(dá)菌株；利用色譜純化技術(shù)設(shè)計(jì)純化路線，純化重組人BMP-4；對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行生理活性檢測(cè)。
- 詳細(xì)介紹：
- 目的：骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（Bone morphogenetic protein 4，BMP4）是一種生長(zhǎng)因子，具有明顯促進(jìn)細(xì)胞組織分化為骨組織的能力，在骨缺損、骨折的修復(fù)和脊柱融合等眾多方面的骨科臨床上有很高的應(yīng)用價(jià)值。從哺乳動(dòng)物骨骼材料中提取的天然BMP-4數(shù)量有限、成本高、且具有免疫源性，限制了其在臨床上的應(yīng)用。為此，我們建立了人BMP-4在畢赤酵母中的高效表達(dá)及純化工藝。 方法：根據(jù)畢赤酵母高表達(dá)基因?qū)μ囟艽a子偏好的特性，選擇畢赤酵母高表達(dá)基因偏好的密碼子，替換人BMP-4成熟肽序列在畢赤酵母高表達(dá)基因中不常用的密碼子，優(yōu)化設(shè)計(jì)人BMP-4成熟肽表達(dá)序列并構(gòu)建重組表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌和篩選高表達(dá)菌株；利用色譜純化技術(shù)設(shè)計(jì)純化路線，純化重組人BMP-4；對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行生理活性檢測(cè)。 結(jié)果：控制表達(dá)序列A+T含量在30-55%的范圍內(nèi)，盡可能使用畢赤酵母高表達(dá)基因偏好的密碼子，優(yōu)化設(shè)計(jì)人BMP-4表達(dá)序列，使人BMP-4的表達(dá)水平提高了4倍，在搖瓶表達(dá)中產(chǎn)量能達(dá)到48mg/L。發(fā)酵上清中的重組人BMP-4用SP Sepharose和heparin親和色譜層析法進(jìn)行純化。對(duì)純化后的人BMP-4進(jìn)行生理活性的檢測(cè)，結(jié)果顯示重組人BMP-4能異位誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的生成和增加效應(yīng)細(xì)胞的堿性磷酸酶的活性，具有生理活性。 結(jié)論：通過(guò)對(duì)人BMP-4表達(dá)序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)，有效地解決了人BMP-4在畢赤酵母中表達(dá)量低的問(wèn)題，同時(shí)建立了重組人BMP4純化工藝，并證明畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)的人重組BMP-4具有明顯的生理活性，為人BMP-4進(jìn)一步的臨床應(yīng)用開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 天然提取的BMP-4數(shù)量有限、成本高、且具有免疫源性，限制了其在臨床上的應(yīng)用。為此，我們建立了人BMP-4在畢赤酵母中的高效表達(dá)及純化工藝。選擇畢赤酵母高表達(dá)基因偏好的密碼子，替換人BMP-4成熟肽序列在畢赤酵母高表達(dá)基因中不常用的密碼子，優(yōu)化設(shè)計(jì)人BMP-4成熟肽表達(dá)序列并構(gòu)建重組表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌和篩選高表達(dá)菌株；純化重組人BMP-4；對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行生理活性測(cè)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 利用畢赤酵母使用的高頻密碼子替換hBMP-4成熟肽序列中的低頻密碼子并控制其序列的A+T含量在30-55%水平，人工設(shè)計(jì)一條hBMP-4成熟肽優(yōu)化序列。優(yōu)化序列通過(guò)人工合成并在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。與原序列相比，密碼子優(yōu)化后序列使hBMP-4的表達(dá)產(chǎn)量提高了4倍，通過(guò)色譜法純化hBMP-4，建立了純化工藝。而純化后hBMP-4顯示出可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的形成和增加堿性磷酸酶的生物活性。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- BMPs是一類廣譜性的蛋白質(zhì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，在臨床醫(yī)學(xué)有很好應(yīng)用前景。但是天然提取的BMPs產(chǎn)量低，費(fèi)用高，無(wú)法很好的應(yīng)用在臨床醫(yī)學(xué)上。本研究通過(guò)優(yōu)化密碼子的手段，使hBMP-4在畢赤酵母中表達(dá)產(chǎn)量提高了4倍，且通過(guò)色譜層析法純化得到BMP-4并對(duì)純化后的hBMP-4的生理活性進(jìn)行鑒定，從而得到高表達(dá)，純化的，有活性的BMP-4。為進(jìn)一步開展臨床應(yīng)用的研究和將來(lái)可能的臨床應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 在最初的表達(dá)研究中，我們將原始的hBMP-4成熟肽序列在畢赤酵母中表達(dá)。盡管hBMP-4在非常強(qiáng)的酵母啟動(dòng)子AOX1控制下表達(dá)，但其在搖瓶培養(yǎng)中表達(dá)量較低。為了提高h(yuǎn)BMP-4的表達(dá)水平，我們利用酵母高表達(dá)基因使用的高頻密碼子替換了hBMP-4原序列中低頻密碼子，設(shè)計(jì)一條表達(dá)序列。該序列只含有酵母偏好的密碼子，同時(shí)A+T含量被控制在30-55%的范圍內(nèi)。密碼子優(yōu)化后使hBMP-4的表達(dá)水平提高了4倍，在搖瓶表達(dá)中產(chǎn)量達(dá)到48mg/L。發(fā)酵上清中的重組hBMP-4用SP Sepharose和heparin親和色譜層析法進(jìn)行純化。對(duì)純化后的rhBMP-4進(jìn)行生理活性的檢測(cè)，結(jié)果顯示rhBMP-4能誘導(dǎo)異位軟骨細(xì)胞的產(chǎn)生和增加效應(yīng)細(xì)胞的堿性磷酸酶的活性。
獲獎(jiǎng)情況
- 無(wú)
鑒定結(jié)果
- 無(wú)
參考文獻(xiàn)
- [1] Shore EM, Xu M, Shah PB, Janoff HB, Hahn GV, Deardorff MA, Sovinsky L, Spinner NB, Zasloff MA, Wozney JM, Kaplan FS. The human bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) gene: molecular structure and transcriptional regulation. Calcif Tissue Int 63(3): 221-229.1998. [2] Selever J, Liu W, Lu MF, Behringer RR, Martin JF.Bmp4 in limb bud mesoderm regulates digit pattern by controlling AER development. Dev Biol 15;276(2): 268-279. 2004. [3] Hosoya A, Kim JY, Cho SW, Jung HS. BMP4 signaling regulates formation of Hertwig's epithelial root sheath during tooth root development. Cell Tissue Res 333(3) :503-509. 2008. [4] Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol 16(1) :23-52. 2000. [5] Cereghino GP, Cereghino JL, Ilgen C, Cregg JM. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol 13(4): 329-332. 2002.
同類課題研究水平概述
- 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)，是一類廣譜性的蛋白質(zhì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，其全長(zhǎng)cDNA約為1.2 kb，轉(zhuǎn)錄、翻譯后具有生理活性的分子是一類磷酸化的二聚體糖蛋白多肽分子。已有的研究表明BMPs不僅對(duì)器官的發(fā)育起關(guān)鍵的作用，而且對(duì)骨質(zhì)的生長(zhǎng)、神經(jīng)細(xì)胞的再生、創(chuàng)口愈合以及神經(jīng)腫瘤的治療等均有明顯的促進(jìn)功能。 國(guó)內(nèi)研究機(jī)構(gòu)多利用原核系統(tǒng)表達(dá)BMPs 。利用原核系統(tǒng)表達(dá)的BMPs要經(jīng)過(guò)煩瑣的變性和復(fù)性過(guò)程。對(duì)于結(jié)構(gòu)較復(fù)雜BMPs分子(有六個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵和一個(gè)鏈間二硫鍵)，復(fù)性的成功率很低，并且原核系統(tǒng)無(wú)法使表達(dá)的BMPs進(jìn)行糖基化加工，因此利用原核系統(tǒng)表達(dá)的BMPs在生理活性上必將受到影響。國(guó)外研究機(jī)構(gòu)則利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)BMPs。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)能表達(dá)出高活性的天然構(gòu)象BMPs，但其表達(dá)量低，需要昂貴的設(shè)備和培養(yǎng)基，使得利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的BMPs成本很高。 為了避免以上兩種表達(dá)系統(tǒng)對(duì)hBMP-4表達(dá)的影響，本課題選用了畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母(Pichia pastoris)是單細(xì)胞真核生物，它既有原核生物生長(zhǎng)快、培養(yǎng)容易、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，因其是真核生物，又能對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行翻譯后加工和修飾，使表達(dá)的外源蛋白具有較高的生物學(xué)活性，因此，非常適合真核蛋白的表達(dá)。2000年之前已有400多種外源蛋白在畢赤酵母中成功表達(dá)，2002年以后，在Pichia pastoris中表達(dá)的外源蛋白又增加了40多種。 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)雖然具有以上的許多優(yōu)點(diǎn)，但也存在著一些缺陷。其中之一是由于物種間對(duì)密碼子偏好的不同造成有些外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)量過(guò)低。為了提高h(yuǎn)BMP-4的表達(dá)量，本課題對(duì)hBMP-4序列進(jìn)行優(yōu)化，研究其對(duì)hBMP-4在畢赤酵母中表達(dá)水平的影響。我們的研究結(jié)果也為其它外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)提供借鑒。
